乳清分離蛋白凝膠蔗糖釋放過程的動力學分析

任 艷，李 娟，何蓮君，董文明，和勁松*

（云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

乳清分離蛋白凝膠蔗糖釋放過程的動力學分析

任 艷，李 娟，何蓮君，董文明，和勁松*

（云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

以蔗糖為食品風味成分，封裝于乳清分離蛋白凝膠內，探討pH值、溫度、載藥量、釋放液離子濃度對乳清分離蛋白凝膠釋放蔗糖的動力學機制。結果表明：蔗糖在乳清分離蛋白凝膠中的釋放過程符合Korsmeyer-Peppas模型，且擬合相關系數R2在0.95～0.99之間，擴散常數n均小于0.45，符合Fick擴散機理。動力學常數K隨pH值、溫度、以及釋放液離子濃度（0.05～0.10 mol/L）的增加而增大，隨載藥量的增加而減小。乳清分離蛋白凝膠具有環境應答性，以其為載體的物質釋放過程受環境溫度、pH值、載藥量、釋放液離子濃度等因素影響。通過調節釋放體系的pH值、溫度、載藥量、釋放液離子濃度可以達到控制載物釋放的目的。

乳清分離蛋白；凝膠；釋放特性；動力學

任艷， 李娟， 何蓮君， 等. 乳清分離蛋白凝膠蔗糖釋放過程的動力學分析［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 13-18. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615003. http://www.spkx.net.cn

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乳清分離蛋白（whey portein isolate，WPI）是干酪生產的副產品，在許多食品產品中被廣泛用作功能性成分［1-2］，因其純度高、吸收率好、氨基酸組合最合理等諸多優勢被推為“蛋白之王”。WPI作為蛋白質替代原料，可降低成本、提高營養價值、改善產品質量［3-5］。凝膠化是WPI的一個重要功能特性，可賦予食品特殊結構和質地［6-10］，因其擁有良好的加工特性，可作為功能性成分的載體［11-16］。蔗糖來源廣泛、價格便宜而其本身又可作為食品中的有益成分，對食品的安全和風味等固有特性影響較少，在工業化大規模利用上前景廣闊［17］。研究表明，利用WPI的凝膠特性，在適合的條件下制備以WPI為壁材的微膠囊，可以對功能性成分進行包埋并實現腸溶釋放［18］。但國內對以食品風味成分封裝乳清分離蛋白凝膠釋放過程的動力學研究尚未見報道，因此本實驗用乳清分離蛋白凝膠對蔗糖進行封裝，對乳清分離蛋白凝膠釋放特性影響因素（pH值、溫度、離子濃度等）及動力學機理進行研究，以期為WPI在新型凝膠食品開發、功能性成分的無損封裝以及控制釋放等現代食品科學技術領域的應用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

WPI（蛋白質含量＞95%） 美國Le Sueur Cheese公司。

蔗糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、冰乙酸、碳酸鈉、氫氧化鈉 天津市風船化學試劑科技有限公司；苯酚、濃硫酸 西隴化工股份有限公司；無水乙酸鈉廣東光華化學廠有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2儀器與設備

PL303型電子天平、FE20型實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；WFJ7200型可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；601超級恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫療儀器廠；TGL-16C高速離心機上海安亭科學儀器廠；XK96-A快速混勻器 姜堰市新康醫療器械有限公司；TTL-10B超純水器 北京同泰聯科技發展有限公司；D-160均質機 鄭州南北儀器設備有限公司。

1.3方法

1.3.1蔗糖封裝的WPI熱凝膠制備

準確稱取16 g WPI和所需蔗糖用量放入燒杯中，加入100 mL蒸餾水，玻璃棒混勻后用均質機處理10 min，使其充分溶解，用自封袋密封， 4 ℃條件下放置12 h后，在85 ℃恒溫水浴鍋中水浴25 min制成蛋白凝膠，于冰水混合物中迅速冷卻后，用刀片切分成1 cm×1 cm×1 cm的正方體凝膠塊。

1.3.2靜態釋放實驗

為了探討釋放環境對WPI凝膠釋放特性影響因素及其動力學規律，建立pH值、溫度、釋放液離子濃度（本實驗中用磷酸鹽緩沖液作為釋放液）、載藥量靜態釋放體系。

1.3.2.1pH值靜態釋放體系

準確稱取16 g WPI和0.06 g蔗糖按1.3.1節方法制成凝膠，將切分好的WPI凝膠塊分別浸泡于20.0 mL，20 ℃（恒溫水浴鍋控溫）、0.05 mol/L，pH 2.0、3.0、4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸鹽緩沖液中，釋放30 min，每隔5 min取釋放液1 mL測定一次蔗糖質量濃度，同時向釋放液體系補充1 mL新緩沖液，以維持釋放體系的體積不變。

1.3.2.2溫度靜態釋放體系

按1.3.2.1節設置釋放體系，控制pH 6.0，磷酸鹽緩沖液離子濃度為0.05 mol/L，載藥量（蔗糖，下同）為0.6 mg/mL，設置體系溫度（電冰箱控溫）分別為4、20、30、40、50 ℃，研究溫度對WPI凝膠釋放特性的影響。

1.3.2.3釋放液離子濃度靜態釋放體系

按1.3.2.1節設置釋放體系，控制pH 6.0、溫度20 ℃、載藥量為0.6 mg/mL，控制磷酸鹽緩沖液濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L，研究釋放液離子濃度對WPI凝膠釋放特性的影響。

1.3.2.4載藥量靜態釋放體系

按1.3.2.1節設置釋放體系，控制pH 6.0、溫度20 ℃、磷酸鹽緩沖液離子濃度為0.05 mol/L，設置載藥量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，研究載藥量對WPI凝膠釋放特性的影響。

1.3.3蔗糖標準曲線繪制

參考Rajeshwair等［19］的方法，配制質量濃度為100 ?g/mL蔗糖標準溶液。取6 支25 mL試管，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的蔗糖標準溶液，按順序向試管中加入體積分數6%的苯酚1.0 mL，搖勻，再沿管壁在5～20 s內加入5.0 mL濃硫酸，靜置10 min后搖勻，室溫放置20 min，于490 nm波長處測定其吸光度，以蔗糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蔗糖標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.009 1x-0.004（R2=0.998 8）。

1.3.4釋放液中蔗糖質量濃度測定

吸取1 mL釋放液，按1.3.3節中蔗糖質量濃度測定方法加入苯酚、濃硫酸反應后于490 nm波長處測定其吸光度，平行測定3 次，取平均值。

1.3.5動力學參數分析方法

為了分析釋放過程，通常運用動力學模型來描述釋放動力學機理，而Korsmeyer-Peppas模型是用來分析活性成分在多孔材料中釋放最為理想的模型［20］。公式如下：

式中：X為累積釋放分數/%；t為釋放時間/min；n為擴散常數；K為動力學常數。

由n來決定動力學機理：當n≤0.45時，活性成分釋放機理符合Fick擴散機理；當0.45＜n＜0.89時，符合非Fick擴散機理；當n≥0.89時，符合以骨架溶蝕為主的機理。累積釋放分數（X）計算公式如下：

式中：mt是時間t時刻的釋放總量/（μg/mL）；m0是釋放所用凝膠塊的載藥量/（mg/mL）；Atotal是凝膠的總載藥量/（mg/mL）；Vdisk是釋放所用凝膠塊的體積/mL；Vtotal是最初配制WPI溶液的體積/mL。通過對不同時刻t釋放液中活性成分質量濃度進行測定，可以得累積釋放分數X，用（1）式對累積釋放分數進行擬合，分析可得釋放過程動力學參數。

1.4數據分析

應用Excel進行繪圖及顯著性分析，顯著性水平選取α=0.05，結果以表示。用Origin軟件進行動力學擬合分析。

2　結果與分析

2.1蔗糖釋放的飽和時間、飽和質量濃度

圖1　WPI釋放液中蔗糖質量濃度的變化Fig. 1 Time course of sucrose release from whey protein isolate gel

蔗糖在WPI凝膠中的釋放質量濃度變化如圖1所示，隨著時間的推移，釋放量先上升，后趨于平衡，存在一個飽和點。

對蔗糖釋放質量濃度上升的部分和趨于飽和的部分分別添加趨勢線（圖2），兩條趨勢線相交處的對應時間即為釋放飽和時間，對應釋放質量濃度即為釋放飽和質量濃度。

圖2　WPI釋放液中蔗糖釋放飽和時間、飽和質量濃度的計算Fig. 2 Calculation of saturated time and saturation concentration during the release of sucrose

2.2pH值對WPI凝膠釋放特性的影響及動力學分析

pH值是生理、生物和化學系統中的重要影響因素。不同pH值條件下蔗糖在WPI凝膠中的釋放質量濃度變化曲線如圖3所示。

圖3　pH值對WPI凝膠釋放特性的影響Fig. 3 Effect of pH on release properties of WPI gel

由圖3可知，在釋放前期蔗糖的釋放質量濃度逐漸增大，隨著釋放時間延長釋放速率逐漸減慢到釋放后期蔗糖釋放質量濃度逐漸飽和。

為了進一步說明不同pH值條件下蔗糖的釋放變化，對釋放過程中蔗糖的飽和時間、飽和質量濃度、釋放比率進行了分析（表1）。

表1　不同pH值條件下蔗糖釋放過程的特征參數Table 1 Characteristic parameters for sucrose release process under different pH conditions

由表1可知，pH值在2.0～8.0時，隨著pH值的升高，蔗糖釋放飽和質量濃度、釋放比率均逐漸增大，但釋放飽和時間與pH值的相關性不大。

為了探明不同pH值下蔗糖釋放過程的動力學機理，按式（1）對不同pH值條件下，蔗糖的累積釋放分數進行動力學擬合分析（圖4）。由圖4可知，各組實驗數據點與模型擬合曲線基本吻合。

圖4　不同pH值條件下蔗糖釋放過程的動力學擬合Fig. 4 Dynamic fitting of sucrose release process under different pH conditions

表2　不同pH值條件下蔗糖釋放過程的動力學擬合參數Table 2 Kinetic fitting parameters for sucrose release process under different pH conditions

由表2可知，隨著pH值的升高，蔗糖釋放的動力學常數K逐漸增大，擴散常數n均小于0.45，符合Fick擴散，相關系數R2均大于0.88。

實驗結果表明，隨著pH值的升高，蔗糖釋放飽和質量濃度、釋放比率逐漸增大；動力學常數逐漸增大，表現出顯著的酸堿敏感性。這可能是由于pH值的增大使WPI凝膠中凝膠網絡發生變化引起的。凝膠在偏堿性的緩沖溶液中的溶脹程度比在酸性緩沖溶液中的溶脹程度大得多，溶脹程度大的凝膠網絡上的間隙比較大，有利于藥物從凝膠中釋放出來［21-22］。因此，凝膠中藥物的釋放速率常數較高。George等［23］以海藻酸鈉和瓜爾膠為原料，合成了具有酸堿敏感性的水凝膠，并以BSA為模型藥物，結果表明，水凝膠在pH 1.2～7.4間具有較好的酸堿敏感性，且具有較好的控制釋放效果。本實驗的研究結果表明乳清白蛋白凝膠在pH 2.0～8.0間具有酸堿敏感性，且pH 7～8間控制釋放效果較好，但酸堿敏感性與George等［23］的研究結果存在差異，這可能是乳清分離蛋白與海藻酸鈉、瓜爾膠的結構不同造成的。Kumar等［24］采用懸浮聚合法制成了基于聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸的凝膠微球，并研究了其在不同pH值條件下對胰島素的釋放過程，發現pH 2.5時，胰島素的釋放量僅為18%～25%；而在pH 7.4時，胰島素的釋放量有顯著增加，本實驗的研究結果與其研究結果一致。

2.3不同溫度對WPI凝膠釋放過程的影響及動力學分析

溫度是生理、生物和化學系統中的重要因素，熱誘導形成的凝膠其性質會隨周圍環境溫度變化而改變。不同溫度下蔗糖在WPI凝膠中釋放質量濃度變化如圖5所示。

圖5　溫度對WPI凝膠釋放特性的影響Fig. 5 Effect of temperature on release characteristics of WPI gel

由圖5可知，隨著溫度的升高，蔗糖的釋放質量濃度逐漸增大。在釋放前期蔗糖的釋放速率快，隨著釋放時間的推移，釋放速率逐漸減慢，最后趨于飽和。

表3　不同溫度條件下蔗糖釋放過程的特征參數Table 3 Characteristic parameters for sucrose release process at different temperatures

由表3可知，蔗糖的釋放質量濃度隨著溫度的升高而逐漸增大。飽和質量濃度、飽和時間以及釋放比率，都隨著釋放體系溫度的升高而增大，在50 ℃條件下，蔗糖釋放的飽和質量濃度及釋放比率高于其他組。

對不同溫度下蔗糖的累積釋放分數按式（1）進行動力學擬合分析，結果見表4。

表4　不同溫度下蔗糖釋放過程的動力學擬合參數Table 4 Kinetic fitting parameters for sucrose release process at different temperatures

由表4可知，隨著溫度的升高，蔗糖釋放的動力學常數K逐漸增大，擴散常數n均小于0.45，相關系數R2均大于0.9。

蔗糖釋放的飽和質量濃度、飽和時間以及釋放比率，都隨著釋放體系溫度的升高而不斷增大（表3），表現出較高的溫度敏感性；動力學常數K也隨著溫度的升高逐漸增大（表4）。這可能是由兩方面原因造成的，一是載物在高溫時，分子自由擴散運動加快，從而使擴散速率加快；二是由于溫度的升高，凝膠會脹開，乳清分離蛋白四級結構伸展，結構變得疏松，從而加速釋放，同時增加了釋放量，導致WPI凝膠在高溫時的釋放比率明顯高于低溫時的釋放比率［25］。楊桔［26］的研究發現，載藥凝膠在37 ℃時的釋放速率明顯高于25 ℃時的釋放速率，表現出顯著的溫度敏感性；潘婷婷［27］研究發現，當釋放溫度從20 ℃升高到40 ℃時，最大釋放量也隨之增大。本研究中釋放溫度從4 ℃升高到50 ℃時，蔗糖的釋放量逐漸增大，與楊桔［26］和潘婷婷［27］的研究結果一致。說明WPI凝膠與其他載物凝膠一樣具有顯著的溫度敏感性。

2.4不同磷酸鹽緩沖液離子濃度對WPI凝膠釋放影響及動力學分析

圖6　離子濃度對WPI凝膠釋放特性的影響Fig. 6 Effect of ion concentration on release characteristics of WPI gel

由圖6可知，在釋放的前10 min，蔗糖的釋放速率快，釋放量大，在10 min以后，蔗糖釋放速率逐漸減慢，最后慢慢達到飽和。

表5　不同釋放液離子濃度條件下蔗糖釋放的特征參數Table 5 Characteristic parameters of sucrose release under different liquid-releasing concentrations

由表5可知，釋放液離子濃度在0.05～0.15 mol/L范圍內，蔗糖釋放的飽和時間在0.10 mol/L的釋放液中最短；飽和質量濃度以及釋放比率，都隨著釋放液離子濃度的增加而增大，當釋放液離子濃度超過0.15 mol/L時，蔗糖釋放的飽和質量濃度以及釋放比率反而降低。

對不同釋放液離子濃度下蔗糖的累積釋放分數按式（1）進行動力學擬合分析，結果見表6。

表6　不同釋放液離子濃度下蔗糖釋放過程的動力學擬合參數Table 6 Kinetic fitting parameters of sucrose-releasing process under different liquid-releasing concentrations

由表6可知，蔗糖釋放的動力學常數K隨著釋放液離子濃度的增加逐漸增大，擴散常數n均小于0.45，符合Fick擴散機理，相關系數R2均大于0.89。

蛋白凝膠在釋放介質具有較低離子強度下有較大的溶脹率，此時凝膠網絡具有較好的可擴展性，使得載物易于從凝膠內部釋放出來。而隨著釋放介質離子強度的逐漸增大，蛋白凝膠中高分子鏈變得卷曲，分子鏈的卷曲增強了分子內疏水締合，大分子鏈間相互作用增強，使分子鏈更為卷曲，因而凝膠與水分子之間的相互作用力逐漸減小，凝膠的溶脹率逐漸下降，導致載物不容易從凝膠中釋放出來，從而釋放速率下降［28-29］。這說明在一定范圍內增加釋放介質中釋放液離子濃度可以增大活性成分的釋放量，改變釋放介質的離子濃度可以改變載物的釋放動力學機制［30-32］。

2.5不同載藥量對WPI凝膠釋放過程的影響及動力學分析

圖7　載藥量對WPI凝膠釋放特性的影響Fig. 7 Effect of drug loading on release characteristics of WPI gel

由圖7可知，隨著載藥量的增加，蔗糖的釋放質量濃度逐漸增大；在釋放前期隨著載藥量增加，釋放速率逐漸增大，在釋放15 min以后，蔗糖釋放質量濃度逐漸減慢，最后趨于飽和。

表7　不同載藥量條件下蔗糖釋放過程的特征參數Table 7 Characteristic parameters for sucrose release process under different loading levels

由表7可知，載藥量0.2～1.0 mg/mL范圍內，蔗糖釋放的飽和時間與載藥量的相關性不大；飽和質量濃度隨著載藥量的增加而增大；釋放比率則隨著蔗糖載藥量的增加而逐漸降低。

對不同載藥量條件下蔗糖的累積釋放分數按式（1）進行動力學擬合得到特征參數，結果見表8。

表8　不同載藥量條件下蔗糖釋放過程的動力學擬合參數Table 8 Kinetic fitting parameters for sucrose release process under different loading levels

如表8所示，隨著載藥量的增加，蔗糖釋放的動力學常數K逐漸降低；擴散常數n均小于0.45；相關系數R2均大于0.9。

實驗結果表明，蔗糖釋放的飽和質量濃度隨著載藥量的增加而增大，釋放比率則隨著載藥量的增加而逐漸降低（表7）。這可能是由于載藥量的增大使乳清分離蛋白凝膠網絡變得疏松多孔，使前期藥物突釋引起的。蔗糖的釋放速率和動力學常數則隨著載藥量的增加而降低（表8），這是因為載藥的質量濃度越大，溶液越黏稠，形成凝膠的結構越致密，對藥物的包埋作用越強，所以藥物從凝膠中釋放出來的速率就越慢，釋放比率就會越低。隨著載藥量增加，載藥釋放速率逐漸下降，這可能是因為載藥質量濃度越大，耐水性越強，交聯密度越高，凝膠的骨架越緊密，溶脹性變小，使進入微球的水量減少，藥物的釋放速率逐漸減慢［33-35］。載藥量的改變使得釋放速率改變，從而使動力學機制也隨之改變。

3　結 論

蔗糖在乳清分離蛋白凝膠中的釋放過程符合Korsmeyer-Peppas模型，且擬合相關系數R2在0.95～0.99之間，擴散常數n均小于0.45，符合Fick擴散機理，動力學常數K（即釋放速率）隨pH值、溫度、以及釋放液離子濃度的增加不斷增大，隨載藥量的增加而不斷減小。WPI凝膠具有環境應答性，以其為載體的物質釋放過程受環境的pH值、溫度、載藥量、釋放液離子濃度等因素影響，通過調節釋放體系的pH值、溫度、載藥量、釋放液離子濃度可以達到控制載物釋放的目的。本研究結果可為乳清分離蛋白在新型凝膠食品開發、功能性成分的無損封裝以及控制釋放、靶向給藥等現代食品科學技術領域的應用提供理論依據。

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Kinetics of Sugar Release from Whey Protein Isolate Gel

REN Yan， LI Juan， HE Lianjun， DONG Wenming， HE Jinsong*
（College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

In this research， the kinetic mechanism of sucrose release from whey protein isolate gels was studied. For this purpose， sucrose as a food flavor component was encapsulated in whey protein gels to investigate the effects of pH，temperature， drug loading， and ion concentration on the kinetics of sucrose release. The results showed that the releasing process of sucrose from whey protein isolate gels could be described by the Korsmeyer-Peppas model， with a fitting correlation coefficient R2between 0.95-0.99. The diffusion constant n was less than 0.45， which is consistent with the Fick diffusion mechanism. With the increase of pH， temperature or ion concentration in the range of 0.05-0.10 mol/L， the kinetic constant K （i.e.， release rate） increased， while it decreased with the increase of drug loading. Whey protein isolate gel exhibited environmental responses， and the release of entrapped sucrose from it could be influenced by pH， temperature，drug loading， ion concentration and other factors. Therefore， the purpose of control ling the release of entrapped contents from the carrier could be achieved by adjusting pH， temperature， drug concentration and ion concentration.

whey protein isolate； gel； release characteristics； kinetics

10.7506/spkx1002-6630-201615003

TS252.1

A

1002-6630（2016）15-0013-06引文格式：

2015-11-24

國家自然科學基金面上項目（31371875）；云南省教育廳科學研究基金重點項目（2014Z081）作者簡介：任艷（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：377100734@qq.com

和勁松（1970—），男，副教授，博士，研究方向為食品蛋白凝膠化理論與功能凝膠開發。

E-mail：hejinsong@mail.tsinghua.edu.cn