高產納豆激酶地衣芽孢桿菌工程菌全合成培養基優化

趙新宇，陳楊陽，陳敬幫，蔡冬波，魏雪團,

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.華中農業大學 農業微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070）

ZHAO Xinyu1,2, CHEN Yangyang2, CHEN Jingbang2, CAI Dongbo2, WEI Xuetuan1,2,*(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

高產納豆激酶地衣芽孢桿菌工程菌全合成培養基優化

趙新宇1,2，陳楊陽2，陳敬幫2，蔡冬波2，魏雪團1,2,*

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.華中農業大學 農業微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070）

以產納豆激酶的地衣芽孢桿菌基因工程菌BL10（pP43SNT-SsacC）為出發菌株，開展其全合成培養基的發酵優化研究。通過單因素試驗和正交試驗優化了全合成培養基成分，獲得了最優的培養基組成（g/L）：葡萄糖30、NaNO330、谷氨酸鈉20、檸檬酸鈉15、MgSO4g7H2O 0.5、K2HPO4g3H2O 1.5、CaCl20.5，pH 7.2。在優化的全合成培養基中，納豆激酶最高酶活力達到25.59 FU/mL，相比于初始培養基發酵活性（4.27 FU/mL），提高了5 倍。對比分析了全合成培養基和半合成培養基的發酵產物，結果表明，全合成培養基可顯著提高納豆激酶的純度，與半合成培養基相比，納豆激酶比活力提高了2 倍。本研究獲得了納豆激酶的全合成培養基成分，顯著提高了納豆激酶發酵活性，并進一步提高了納豆激酶發酵純度。

納豆激酶；地衣芽孢桿菌工程菌；全合成培養基；發酵優化

心血管疾病嚴重危害人類健康，已成為威脅人類生命的“頭號殺手”[1]。血栓是造成心血管疾病的主要原因，血栓的主要成分是纖維蛋白[2]，溶解纖維蛋白對預防和治療心血管疾病具有重要的意義。納豆激酶（nattokinase，NK）不僅可直接降解纖維蛋白，而且可激活體內纖溶酶的形成，促進纖維蛋白的降解[3-4]，因而對治療和預防心血管疾病具有重要的意義。NK溶栓性強，半衰期長，無毒副作用，已被開發為保健食品，深受心血管疾病患者的青睞[5]。

目前，NK多是通過野生納豆芽孢桿菌發酵生產[6]。野生菌株合成納豆激酶的途徑復雜，是多種代謝途徑共同參與的結果[7]。其中，添加無機氮源可抑制NK的合成，因此，野生菌發酵過程中往往需要大量有機氮源成分[8-9]，如固體發酵多以天然黃豆為底物進行發酵，液體發酵多是利用半合成培養基進行發酵[10-11]。由于天然培養基和半合成培養基成分多樣，雜蛋白、多肽比較多，導致分離純化過程復雜[12-13]，制備高純度產品成本較高[14]。同時，野生菌分泌胞外雜蛋白種類繁多，增加了NK分離純化的難度[15]。因此，減少培養基天然雜蛋白和生產菌自身雜蛋白含量，有望提高NK的純度。

本實驗室前期構建了10基因缺失的新型地衣芽孢桿菌宿主菌BL10，敲除了野生菌中大量的胞外蛋白酶和冗余蛋白，降低胞外蛋白酶對NK的降解作用，實現了NK的高效組成型表達[16]，但還未從全合成培養基角度進行NK發酵優化。因此，本研究以前期構建的地衣芽孢桿菌工程菌為出發菌株，進行其全合成培養基優化研究，有助于提高NK的純度，獲得高活性的NK產品。

1 材料與方法

1.1 菌種

地衣芽孢桿菌工程菌株BL10（pP43SNT-SsacC），為華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室微生物工程室構建保存，可組成型表達NK。

1.2 試劑

纖維蛋白原、凝血酶 美國Sigma-Aldrich公司；酵母抽提物、胰蛋白胨 英國Oxoid公司；葡萄糖 西王藥業有限公司；谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、NH4Cl、NaNO3、谷氨酸鈉、MnSO4等 國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 培養基

LB固體培養基（g/L）：酵母抽提物5、胰蛋白胨10、NaCl 10、瓊脂粉20，pH 7.2；LB液體培養基（g/L）：酵母抽提物5、胰蛋白胨10、NaCl 10，pH 7.2；初始發酵培養基（g/L）：蔗糖10、NH4Cl 10、檸檬酸鈉 5、谷氨酸鈉5、MnSO4gH2O 0.15、MgSO4g7H2O 1、K2HPO4g3H2O 1、CaCl21，pH 7.2。在本實驗中，根據研究目的，調整碳源、氮源、無機鹽及其他成分種類和用量。

半合成培養基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨10、大豆蛋白胨10、酵母粉15、玉米漿5、K2HPO4g3H2O 0.5、MgSO4g7H2O 0.1、CaCl2g2H2O 0.1，pH 7.2～7.4。

1.4 發酵方法

1.4.1 種子培養

取BL10（pP43SNT-SsacC）甘油管保藏的菌液，劃線至LB（四環素質量濃度20 μg/mL）固體培養基，37 ℃培養18 h，保存至4 ℃冰箱中，備用；挑取單菌落接種至液體LB（四環素質量濃度20 μg/mL），37 ℃、240 r/min培養12 h活化菌體，按2%的接種量接種至液體LB（四環素質量濃度20 μg/mL）中，37 ℃、240 r/min培養8 h，即為發酵種子液。

1.4.2 發酵培養條件

按照3%的接種量將種子液接種于裝有30 mL發酵培養基的250 mL搖瓶中，37 ℃、240 r/min培養36 h。

1.4.3 單因素試驗優化

在初始發酵培養基的基礎上，通過單因素試驗考察碳氮源種類、碳氮源質量濃度、谷氨酸鈉質量濃度、檸檬酸鈉質量濃度、金屬鹽離子濃度等因素對酶活力的影響：碳源種類包括葡萄糖、蔗糖、木糖、麥芽糖、可溶性淀粉，質量濃度均為10 g/L；選擇適宜碳源，質量濃度梯度設為0、10、20、30、40、50 g/L；氮源種類包括NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2CO3、NaNO3，質量濃度均為10 g/L；選擇適宜氮源，氮源質量濃度梯度設為0、10、20、30、40、50 g/L；谷氨酸鈉質量濃度梯度設為5、10、15、20 g/L；檸檬酸鈉質量濃度梯度設為0、5、10、15、20 g/L；MnSO4質量濃度梯度設為0、0.05、0.10、0.15、0.20 g/L；MgSO4質量濃度梯度設為0、0.5、1.0、1.5 g/L；CaCl2質量濃度梯度設為0、0.5、1.0、1.5 g/L；K2HPO4質量濃度梯度設為0、0.5、1.0、1.5 g/L。

1.4.4 正交試驗優化

在單因素試驗優化的基礎上，設計四因素三水平正交試驗，優化碳氮源質量濃度、谷氨酸鈉和檸檬酸鈉質量濃度，確定最優組合。

1.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

取0.9 mL發酵上清液，加入0.1 mL的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，顛倒10 次混勻，4 ℃過夜放置，13 000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.2 mL無水乙醇洗滌，13 000 r/min離心10 min，棄上清，依此重復洗滌3 次，37 ℃吹干，加入30 μL包含8 mol/L尿素和2 mol/L硫脲溶液溶解蛋白質樣品，再加入30 μL 2hSDS-PAGE上樣緩沖液和3 μL 1 mol/L二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），100 ℃水浴10 min溶解沉淀。SDS-PAGE凝膠參考《分子克隆實驗指南》進行配制[17]。將溶解好的蛋白質離心后取20 μL上樣，用80 V的電壓電泳，當溴酚藍指示劑從濃縮膠進入分離膠后，電壓調到120 V，繼續電泳直到溴酚藍指示劑抵達分離膠底部，斷開電源停止電泳。電泳結束后，于考馬斯亮藍R250染色液中處理1～2 h，最后于脫色液中處理數次直至條帶清晰。

1.6 納豆激酶酶活力測定

本研究采用纖維蛋白原溶解法測定NK活性[18]。反應中所需的纖維蛋白原溶液、凝血酶溶液都用50 mmol/L的Tris-HCl（pH 7.8）溶液配制，向試管中加入1.8 mL纖維蛋白原溶液（2 mg/mL），然后加入0.1 mL凝血酶溶液，37 ℃恒溫箱中靜置10 min，形成纖維蛋白凝塊；加入0.1 mL稀釋后的待測酶液，放入恒溫箱開始計時，每20 min輕輕晃動一次，反應1 h后，迅速加入2 mL TCA溶液（100 g/L）終止反應，靜置20 min；10 000 r/min離心10 min，取上清液在275 nm波長處測定其吸光度值，1 個單位的酶活力（1 FU）定義為每分鐘使吸光度值增加0.01所需要的納豆激酶的量。

2 結果與分析

2.1 全合成培養基優化結果

2.1.1 碳源優化結果

圖1 碳源種類及最適碳源質量濃度對NK酶活性的影響Fig.1 Effect of carbon source type and glucose concentration on nattokinase activity

如圖1A所示，當菌體在初始培養基以蔗糖為碳源時，發酵活性達4.27 FU/mL，當以葡萄糖、木糖、麥芽糖和可溶性淀粉為碳源時，都能提高NK的發酵活性，其中，葡萄糖可促進合成最高的NK發酵活性。因此，葡萄糖為地衣芽孢桿菌BL10（pP43SNT-SsacC）合成NK的最適碳源，這與先前在枯草芽孢桿菌中報道的結論相一致[19-20]。

以葡萄糖為碳源，研究了不同葡萄糖質量濃度對NK活性的影響。不添加葡萄糖時，仍能檢測到微弱的NK活性，這是由于培養基中檸檬酸鈉和谷氨酸鈉可作為碳源供菌體利用。添加葡萄糖后，NK活性顯著提高，當葡萄糖質量濃度超過20 g/L時，NK發酵活性沒有顯著性變化，因此，選擇20 g/L為NK發酵的適宜碳源質量濃度，與先前報道的結果接近[21]。

2.1.2 氮源優化結果

首先，考察了氮源種類對NK發酵活性的影響，在以NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl和NaNO3為氮源時，可以獲得較高活性的NK（圖2A），說明無機氮源可作為基因工程菌表達NK的適宜氮源。在野生菌中，無機氮源如銨鹽可抑制NK的合成，先前的報道都是以有機氮源進行發酵[19]。本實驗所用基因工程菌可組成型表達NK，在調控機制上與野生菌不同，這可能是無機氮源促進NK表達的原因。

選擇NaNO3作為適宜氮源，考察不同質量濃度NaNO3對NK發酵活性的影響，結果如圖2B所示，由于谷氨酸鈉可以作為氮源被細菌利用，因此，不添加NaNO3時，細菌仍可合成NK，但活性較低，添加NaNO3后，活性顯著提高，當NaNO3質量濃度為20 g/L時，NK發酵活性達到最大。

圖2 氮源種類及最適氮源質量濃度對NK酶活性的影響Fig.2 Effect of nitrogen source type and NaNO3concentration on nattokinase activity

2.1.3 不同谷氨酸鈉質量濃度對納豆激酶發酵活性的影響

先前的報道發現谷氨酸鈉是NK重組表達的限制性因素，添加谷氨酸鈉可顯著提高NK的分泌表達[22]，因此，本研究考察了不同谷氨酸鈉質量濃度對NK發酵的影響。圖3顯示在不同谷氨酸鈉質量濃度下NK的發酵活性，當谷氨酸鈉質量濃度為10 g/L時，NK發酵活性達到最大值，因此，初步選擇10 g/L的谷氨酸鈉為適宜質量濃度。

圖3 不同谷氨酸鈉質量濃度對NK酶活性的影響Fig.3 Effect of sodium glutamate concentration on nattokinase activity

2.1.4 不同檸檬酸鈉質量濃度對納豆激酶酶活性的影響

圖4 不同檸檬酸鈉質量濃度對NK酶活性的影響Fig.4 Effect of sodium citrate concentration on nattokinase activity

由圖4可知，不添加檸檬酸鈉時，發酵活力只有3.85 FU/mL，添加5 g/L的檸檬酸鈉，發酵活性顯著提高，說明檸檬酸鈉對NK發酵活性較大的促進作用。推測其原因如下：檸檬酸是三羧酸循環的重要中間代謝物，可促進谷氨酸的合成，進而促進NK的表達。當檸檬酸鈉質量濃度為20 g/L時，發酵活性最高，因此選擇20 g/L的檸檬酸鈉為適宜發酵條件。野生菌在20 g/L的檸檬酸鈉質量濃度時，NK活性很低[6]，這進一步說明工程菌和野生菌在NK合成調控機制上的不同。

2.1.5 不同無機鹽質量濃度對納豆激酶酶活性的影響

圖5 不同無機鹽質量濃度對NK酶活性的影響Fig.5 Effect of inorganic salt concentration on nattokinase activity

由圖5可知，添加MnSO4可降低發酵活性，因此培養基中不需要添加MnSO4。添加MgSO4、CaCl2、K2HPO4可顯著提高NK發酵活性，適宜質量濃度分別為MgSO40.5 g/L、CaCl20.5 g/L、K2HPO41.5 g/L。

2.1.6 正交試驗優化發酵培養基的組成

表1 發酵培養基組分正交試驗方案及結果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of medium components

在單因素優化的基礎上，選擇4 種主要培養基成分葡萄糖、NaNO3、谷氨酸鈉和檸檬酸鈉，設計四因素三水平正交試驗及其結果如表1所示，極差R值大小順序為：A＞C＞B＞D，說明葡萄糖質量濃度對NK活性影響最大，其次是谷氨酸鈉質量濃度、NaNO3質量濃度和檸檬酸鈉質量濃度。K值分析結果顯示，4 種成分的最優組合為A3B3C3D3，即葡萄糖30 g/L、NaNO330 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、檸檬酸鈉15 g/L，最適質量濃度與上述單因素試驗所得結果不一致，分析其原因，可能是4 種成分之間存在交互作用，這也正是正交試驗相比單因素試驗的優點，可以綜合考察單因素之間的交互作用，獲得最優的水平組合。依據此組合進行發酵驗證實驗，最終NK活力為25.78 FU/mL，高于正交試驗中所有的組合，說明該配比確實為最適產酶培養基。綜合單因素試驗和正交試驗結果，確定NK的適宜發酵培養基組成為：葡萄糖30 g/L、NaNO330 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、檸檬酸鈉15 g/L、MgSO4g7H2O 0.5 g/L、K2HPO4g3H2O 1.5 g/L、CaCl20.5 g/L，pH 7.2。

2.1.7 NK發酵過程曲線

以最適產酶培養基為基礎，進行NK發酵過程曲線繪制，包括菌體生長及NK合成過程。如圖6所示，隨著菌體的生長，NK快速合成，NK的合成與生長相偶聯，這與前期的報道相符[23]。同時NK在發酵初期合成速率較快，這可能是由于NK游離表達質粒在初期相對穩定，隨著菌體的生長，出現部分質粒丟失現象，導致后期合成速率下降。發酵18 h時，NK活性達到最大，為25.59 FU/mL，比初始發酵培養基發酵活性（4.27 FU/mL）相比，提高了5 倍。目前，NK工業化生產多以固體發酵納豆的形式進行，商業化納豆產品的NK酶活力在20～40 FU/mL[24-25]，本實驗所得的最大NK酶活性達到了商業化固體發酵工藝的水平，具有良好的應用前景。

圖6 菌體生長曲線及NK活性曲線Fig.6 Time courses of cell growth and nattokinase activity

2.2 全合成培養基發酵產物分析

將最適培養基得到的發酵產物進行SDS-PAGE分析，同時以實驗室先前優化的半合成培養基為對照[16]，結果如圖7所示，其中分子質量約為27.7 kD的條帶為NK條帶，與已有報道的結果相一致[16]。由于半合成培養基以蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉和玉米漿為氮源，含有大量雜蛋白和多肽類物質，故發酵產物中雜帶較多，相比之下，本研究所得的全合成培養基中無雜蛋白，發酵產物中雜蛋白較少，易于純化。以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標準品分析發酵液中總蛋白含量，計算兩種發酵液中NK的酶比活力，全合成培養基發酵液中總蛋白含量為100 mg/L，NK的酶比活力達到255.90 FU/mg pro，半合成培養基發酵液的總蛋白含量為400 mg/L，發酵酶活力和酶比活力分別為33.83 FU/mL和84.58 FU/mg pro，相比之下，全合成培養基比半合成培養基發酵制備的NK酶比活力提高了2 倍，說明全合成培養基有利于高純度NK的發酵制備。

圖7 不同培養基成分發酵產物的SDS-PAGE分析結果Fig.7 SDS-PAGE of fermented products from different media

3 討 論

本研究獲得了納豆激酶發酵的最適全合成培養基成分：葡萄糖30 g/L、NaNO330 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、檸檬酸鈉15 g/L、MgSO4g7H2O 0.5 g/L、K2HPO4g3H2O 1.5 g/L、CaCl20.5 g/L，pH 7.2，最大NK活力達到25.59 FU/mL，相比于初始培養基的發酵活性（4.27 FU/mL）提高了5 倍。與半合成培養基相比，全合成培養基所發酵制備的納豆激酶中雜蛋白顯著降低，納豆激酶比活性提高了2 倍，有利于獲得高純度的納豆激酶產品。本研究提供了一種高效生產納豆激酶的全合成培養基配方，并有利于制備高純度的納豆激酶產品。

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Optimization of Synthetic Complete Medium for Enhanced Nattokinase Production by Genetically Engineered Bacillus licheniformis

The nattokinase-producing genetically engineered strain, Bacillus licheniformis BL10 (pP43SNT-SsacC) was used in this study, and the synthetic complete medium composition for nattokinase production by the strain was optimized using combination of single factor and orthogonal tests. The maximum nattokinase activity of 25.59 FU/mL, which was 6 times higher than that (4.27 FU/mL) before optimization, was obtained using a medium consisting of 30 g/L glucose, 30 g/L NaNO3, 20 g/L sodium glutamate, 15 g/L sodium citrate, 0.5 g/L MgSO4·7H2O, 1.5 g/L K2HPO4·3H2O and 0.5 g/L CaCl2at pH 7.2. The specific activity of nattokinase in the synthetic complete medium was improved by 3 folds when compared with that in semi-synthetic medium. In the present study, both the activity and purity of nattokinase were improved obviously by using the optimized synthetic complete medium.

nattokinase; genetically engineered Bacillus licheniformis; synthetic complete medium; fermentation optimization

ZHAO Xinyu1,2, CHEN Yangyang2, CHEN Jingbang2, CAI Dongbo2, WEI Xuetuan1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

10.7506/spkx1002-6630-201607026

Q812

A

1002-6630（2016）07-0140-06

趙新宇, 陳楊陽, 陳敬幫, 等. 高產納豆激酶地衣芽孢桿菌工程菌全合成培養基優化[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 140-145. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607026. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Xinyu, CHEN Yangyang, CHEN Jingbang, et al. Optimization of synthetic complete medium for enhanced nattokinase production by genetically engineered Bacillus licheniformis[J]. Food Science, 2016, 37(7): 140-145. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607026. http://www.spkx.net.cn

2015-05-08

湖北省自然科學基金項目（2014CFB943）；華中農業大學自主科技創新基金項目（2662015QC035）

趙新宇（1992—），女，本科生，研究方向為食品發酵。E-mail：414949799@qq.com

*通信作者：魏雪團（1984—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：weixuetuan@mail.hzau.edu.cn