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兩株素食者腸道菌產β-葡萄糖苷酶考察及產酶條件優化

2016-11-14 08:38:54李笑梅馬慧玲
食品科學 2016年7期
關鍵詞:大豆

李笑梅,馬慧玲

(哈爾濱商業大學 黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150076)

兩株素食者腸道菌產β-葡萄糖苷酶考察及產酶條件優化

李笑梅,馬慧玲

(哈爾濱商業大學 黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150076)

采用對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷法,與黑曲霉相比較考察素食者腸道菌LJ-G1、LJ-Q2產β-葡萄糖苷酶能力,再經單因素、響應面試驗對菌種的產酶條件進行優化。結果表明:LJ-G1、LJ-Q2菌株均能產β-葡萄糖苷酶,且LJ-Q2產酶能力高于LJ-G1,與黑曲霉相比較,在發酵時間短于64 h時LJ-G1、LJ-Q2產酶能力高于黑曲霉;LJ-Q2菌種的最優產酶條件為:培養基pH 8.0、培養溫度38 ℃、培養時間38 h。在最優條件下進行驗證實驗,酶活力達到1.70 IU/mL。加入大豆異黃酮原料進行發酵培養,得到游離大豆異黃酮轉化率為39.4%。

素食者;腸道菌;β-葡萄糖苷酶;產酶條件

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)又叫β-D-葡萄糖苷水解酶,可以將結合型的大豆異黃酮水解為糖基和游離型的大豆苷元[1-2]。在人體內糖苷型的異黃酮不能直接被吸收,而是先被小腸的β-葡萄糖苷酶水解后脫去糖基進入血液中,才能發揮各種生理作用[3]。腸道細菌在異黃酮的代謝中起到了關鍵的作用[4],部分益生菌還可以將大豆苷元進一步代謝為雌馬酚,與苷元相比它與雌激素受體的結合力更強[5]。

現今產β-葡萄糖苷酶的菌種研究主要集中在酵母[6]、曲霉、木霉以及細菌內[7]。其中曲霉被普遍認為是產β-葡萄糖苷酶的優良菌種,尤以黑曲霉的效率最高[5]。但是黑曲霉發酵到達產酶高峰期要96~144 h[8-9],工業化生產周期較長成本較大。近幾年益生菌產β-葡萄糖苷酶發酵大豆異黃酮呈現研究熱,有些益生菌[10-11]不僅可以轉化糖苷型大豆異黃酮,還有維持腸道、生殖系統、皮膚等正常菌群,抗感染、助降低膽固醇、抑制癌細胞和增強免疫功能等[12]。LJ-G1、LJ-Q2兩株菌是從素食者糞便中分離出來的具有代謝大豆異黃酮產雌馬酚的能力[13-14],大豆苷元是此代謝過程的中間產物之一[1],所以推測兩種菌株可能有產β-葡萄糖苷酶的能力,而且兩種腸道菌的生長曲線表明[15],指數生長期6~24 h、穩定期24~39 h活菌數達到最大值。據此研究探討LJ-G1、LJ-Q2腸道菌產β-葡萄糖苷酶特性及產酶條件優化,旨在為豐富產β-葡萄糖苷酶菌種理論知識,也為后續開發以復合生物發酵法制備大豆苷元提供適宜的菌株資源和工藝技術參數,具有實際應用意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

對照菌株:黑曲霉(Aspergillus niger)由哈爾濱商業大學食品工程學院微生物實驗室提供;菌株LJ-G1、LJ-Q2從素食者糞便中分離獲得。

對硝基苯酚、檸檬酸 天津市光復精細化工研究所;對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷 上海金穗生物科技有限公司;所有試劑均為分析純。

1.2 培養基

腦心浸出液培養基(brain heart influsion broth,BHI)青島海博生物技術有限公司。

麩皮培養基:麩皮0.5%、(NH4)2SO40.4%、K2HPO40.3%、MgSO40.05%、CaCl20.05%、FeSO40.005%、ZnCl20.000 14%、吐溫-80 20 μL,pH 4.8。

1.3 儀器與設備

Agilent 1200LC高效液相色譜 美國安捷倫公司;722型光柵分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;超凈操作臺 上海凈化設備有限公司;YQX-II型培養箱 上海新苗醫療機械有限公司。

1.4 方法

1.4.1 產β-葡萄糖苷酶菌株的初篩方法

采用顯色反應[16],判斷是否產β-葡萄糖苷酶。用0.1%的剛果紅對形成單菌落的平板染色處理10 min,再用1 mol/L的NaCl溶液脫色20 min,如果菌落周圍產生透明圈說明該菌有產β-葡萄糖苷酶的能力。

1.4.2 3 種菌產β-葡萄糖苷酶酶活力比較

采用以對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside,pNPG)為底物測定酶活力[17-19]。

1.4.2.1 對硝基苯酚標準曲線的繪制

用pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配制濃度為0、10、20、30、40、50、60 μmol/L的對硝基苯酚溶液,分別取2 mL上述稀釋后的溶液至10 mL比色管中,于45 ℃水浴鍋中水浴30 min后,加入4 mL 0.5 mol/L的碳酸鈉溶液,混合均勻,于試管架中冷卻至室溫。在400 nm波長處測定吸光度(A400nm),繪制標準曲線。

1.4.2.2 培養基中酶活力的測定

將所試菌種黑曲霉接種于麩皮液體培養基中,28 ℃培養24~144 h;LJ-G1、LJ-Q2腸道菌分別接種于BHI液體培養基中,37 ℃厭氧培養24~144 h,每12 h測一次酶活力。各培養時段的培養基經3 000 r/min離心20 min,得3 種粗酶液,各吸取2 mL于比色管中,再分別加入10 mL pH 5.0的緩沖液,2 mL 50 mmol/L對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液。其余實驗過程同1.4.2.1節。參比溶液:以2 mL未發酵培養基代替發酵培養基。

酶活力定義:每分鐘水解生成1 μmol/L對硝基苯酚所需要的酶量為一個酶活力單位。按公式(1)計算酶活力[20-23]。

式中:X為發酵培養基中粗酶液酶活力/(IU/mL);c為根據實際樣液的吸光度計算出的對硝基苯酚濃度/(μmol/L);N為試樣溶液反應前的總稀釋倍數;t為反應時間/min;V為酶反應液用量/mL。

1.4.3 產酶條件單因素試驗

在篩選出產酶優勢菌株的前提下,進行產酶單因素試驗。固定因素水平設定為培養基pH 7.0、接種量5%、培養溫度37 ℃、培養時間36 h,在此基礎條件下,以酶活力為評價指標,選出適宜因素水平范圍。

1.4.3.1 培養基初始pH值對菌種產酶酶活力的影響

在接種量5%、培養溫度37 ℃、培養時間36 h條件下,分別考察培養基初始pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0對菌種產酶活力的影響。

1.4.3.2 培養時間對菌種產酶酶活力的影響

在培養基初始pH 7.0、接種量5%、培養溫度37 ℃條件下,分別考察培養時間在24、36、48、60、72 h時對菌種產酶活力的影響。

1.4.3.3 培養溫度對菌種產酶酶活力的影響

在培養基初始pH 7.0、接種量5%、培養時間36 h條件下,分別考察培養溫度為33、35、37、39、41 ℃時對菌種產酶活力的影響。

1.4.3.4 接種量對菌種產酶酶活力的影響

在培養基初始pH 7.0、培養溫度37 ℃、培養時間36 h條件下,分別考察1%、3%、5%、7%、9%接種量對菌種酶活力的影響。

1.4.4 響應曲面優化產酶條件

以單因素試驗結果為依據,設計培養基初始pH值、培養溫度、培養時間三因素做響應曲面試驗。以培養基中的酶活力為指標,確定最佳產酶條件。

1.4.5 最優產酶條件下大豆苷元轉化率的測定

采用高效液相色譜法測定,固定相為Agilent1200 LC C18柱(250 mmh4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇-水,0 min 20∶80(V/V,下同),40 min 60∶40,進行梯度洗脫,流速為1.2 mL/min,柱溫為40 ℃,檢測波長為259 nm。將配制成的0.048、0.096、0.144、0.192、0.24 mg/mL系列質量濃度大豆異黃酮混合標準溶液[18]依次進樣。利用峰面積繪制標準曲線。根據公式(2)計算大豆異黃酮含量。

式中:ρ為由各類型大豆異黃酮回歸方程得出其質量濃度/(μg/mL);m為樣品質量/g;V為定容體積/mL。

將菌液接種培養基中,再加入0.3 g大豆異黃酮粉,在最優條件下發酵培養,然后培養液經3 000 r/min離心30 min,吸取上清液進入高效液相色譜進行檢測,與未接菌培養基進行比較,計算游離型大豆異黃酮轉化率。

式中:m1為原料中游離型異黃酮含量/mg;m2為發酵后游離型異黃酮含量/mg。

2 結果與分析

2.1 產β-葡萄糖苷酶能力顯色反應結果

LJ-G1桿菌、LJ-Q2球菌均產生透明圈,說明兩種菌具有產β-葡萄糖苷酶的能力。

2.2 3 種菌產β-葡萄糖苷酶活力比較

圖1 3 種菌產β-葡萄糖苷酶酶活力的比較Fig.1 Comparison of β-glucosidase activities from three strains

由圖1可知,3 種菌在培養36 h時均產酶,酶活力最高的是LJ-Q2,達到1.60 IU/mL。此時黑曲霉產酶能力最低,隨著培養時間的增加,黑曲霉產酶能力逐漸增加,而LJ-Q2、LJ-G1產酶能力逐漸降低,當培養時間達到64 h時,3 種菌產酶能力相同,之后產酶能力從大到小順序為黑曲霉>LJ-Q2>LJ-G1。故以下優化試驗均用LJ-Q2菌種。

2.3 產酶條件單因素試驗

2.3.1 培養基初始pH值對菌種產酶活力的影響

一銨國內市場高位盤整,出廠報價受成本支撐,仍處高位,價格暫無下滑風險。二銨方面,秋季節市場需求釋放,出口市場較為穩定,內銷市場仍在加大,估計后期冬儲市場價格仍會有所上揚。

圖2 培養基初始pH值對菌種產酶活力的影響Fig.2 Effect of initial medium pH on β-glucosidase activity

如圖2所示,當培養基初始pH值為4.0時菌株產酶能力較低,當pH值為8.0時產酶能力達到最高,之后酶活力開始下降,表明LJ-Q2在培養基初始pH值為7.0~9.0時產酶能力相對較強。

2.3.2 培養時間對菌種產酶活力的影響

圖3 培養時間對菌種產酶活力的影響Fig.3 Effect of incubation time on β-glucosidase activity

如圖3所示,菌株在培養時間達到36 h時產酶能力達到最高,之后酶活力隨培養時間的延長而下降,表明該菌的最適培養時間在24~48 h。

2.3.3 培養溫度對菌種產酶活力的影響

圖4 培養溫度對菌種產酶活力的影響Fig.4 Effect of culture temperature on β-glucosidase activity

如圖4所示,培養溫度為33 ℃時,菌株產酶能力較低,當培養溫度達到39 ℃時菌株產酶能力達到最高,此后隨著溫度升高酶活力下降,表明該菌最適培養溫度為37~41 ℃。

2.3.4 接種量對菌種產酶活力的影響

圖5 接種量對菌種產酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum amount on β-glucosidase activity

如圖5所示,接種量1%時,菌株產酶能力較低,隨著接種量的增加,菌株產酶能力隨之增大,當接種量達到5%時,菌株產酶能力達到最高,此后隨著接種量升高酶活力變化不顯著(P>0.05),表明該菌種最適接種量為5%。

2.4 響應面試驗結果分析

表1 培養條件響應面試驗方案設計及結果Table 1 Response surface design and results for the optimization of culture conditions

培養條件響應面試驗各因素和水平見表1,酶活力最高為1.60 IU/mL。產酶條件響應面回歸方程及顯著性分析見表2。利用Design-Expert軟件對表2的響應曲面法試驗設計結果的數據進行了多元回歸擬合分析,得到回歸方程:

表2 響應面回歸方程系數及顯著性檢驗Table 2 Significance test of all coefficients in the regression model

由表2可知,試驗所選用的模型高度顯著(P<0.000 1),模型的校正決定系數=0.951 1,說明該模型能解釋95.11%響應值的變化,相關系數R=0.993 0,說明該模型擬合程度良好,試驗誤差小,該模型是合適的。從回歸方程系數顯著性檢驗可知,模型一次項A、B極顯著(P<0.01),C顯著(P<0.05);二次項AB、AC極顯著(P<0.01),BC不顯著(P>0.05),各因素對酶活力的影響程度排序為A>B>C。

圖6 培養基初始pH值、培養時間、培養溫度間的交互作用對酶活力影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots for the effect of time, initial medium pH and temperature on β-glucosidase activity

由圖6a可知,當培養溫度為39 ℃時,隨培養時間的延長,酶活力逐漸增加,當培養時間在38 h左右時酶活力達到最大,之后又慢慢下降。隨著培養基初始pH值的增加,酶活力增大,在培養基初始pH值為8左右時,酶活力為最大,之后又呈下降趨勢。

由圖6b可知,當培養時間為39 h時,隨著培養基初始pH值的增大,酶活力逐漸增大,當培養基初始pH值在8左右時酶活力達到最大,之后又慢慢下降。隨著培養溫度的增加,酶活力增大,在培養溫度為38 ℃左右時,酶活力為最大,之后又呈下降趨勢。

由圖6c可知,當培養基初始pH值為8時,隨培養時間的延長,酶活力逐漸增大,當培養時間在38 h左右時酶活力達到最大,之后又慢慢下降。隨著培養溫度的增加,酶活力增大,在培養溫度為38 ℃左右時,酶活力為最大,之后又呈下降趨勢。

響應面產酶條件優化結果為:培養基初始pH 8.04、培養溫度38.31 ℃、培養時間38.21 h。根據實際情況校正值為:培養基pH 8.0、培養溫度38 ℃、培養時間38 h,在此條件下測得酶活力為1.7 IU/mL,比未優化前酶活力1.60 IU/mL提高了6.2%。

2.5 發酵培養游離型大豆異黃酮苷元轉化率結果

表3 3 種游離型大豆異黃酮含量Table 3 Contents of three soybean isoflavone aglycons before and after fermentation mg

由表3可知,發酵后3 種游離型大豆異黃酮含量比發酵前高,共增加了1.89 mg,根據公式(3)計算游離型大豆異黃酮轉化率為39.4%。

3 結 論

素食者糞便分離到的腸道菌LJ-G1和LJ-Q2有產β-葡萄糖苷酶的能力,在38 ℃培養36 h時、產酶能力比黑曲霉高。LJ-Q2菌株響應面試驗產酶條件優化結果為:培養基初始pH 8.0、培養溫度38 ℃、培養時間38 h。在此條件下酶活力達到1.70 IU/mL,比未優化前酶活力提高了6.2%。此條件應用于發酵大豆異黃酮其轉化率為 39.4%。近幾年對腸道菌產β-葡萄糖苷酶多有研究。Raimondi等[24]研究了雙歧桿菌屬8 個菌種的22 個菌株轉化大豆苷的能力,發現在發酵7 d內,除Bifidobacteria longum MB220和Bifidobacteria longum MB224外,其他菌株都能水解大豆苷,其中Bifidobacteria adolescentis MB116在生長穩定期的早期就有最高的酶活力,酶活力達0.92 U/mg。也有研究表明鏈球菌[25]等細菌可轉化結合型大豆異黃酮。LJ-Q2腸道菌與黑曲霉相比雖然產酶活力低,但是達到峰值的時間短于黑曲霉108 h,以進一步轉化成雌馬酚,因此,LJ-Q2腸道菌具有很好的應用前景。接下來的工作將探討LJ-Q2腸道菌與其他產β-葡萄糖苷酶的腸道益生菌進行復合,以提高產β-葡萄糖苷酶的能力,應用于大豆苷元的制備,這對今后雌馬酚的轉化也有著重要的意義。

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Comparison of Two β-Glucosidase-Producing Strains from the Intestinal Tract of Vegetarians and Optimizaiton of Fermentation Conditions for β-Glucosidase Production

LI Xiaomei, MA Huiling
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The β-glucosidase-producing capacity of strains LJ-G1 and LJ-Q2 isolated from the feces of vegetarians was measured using 4-nitrophenol-β-D-glucoside (pNPG) as substrate and compared with that of Aspergillus niger. The fermentation conditions for β-glucosidase production by the selected strain were optimized using combination of single factor method and response surface methodology. The results showed that both intestinal strains were able to produce β-glucosidase, and LJ-Q2 had higher β-glucosidase-producing capacity than LJ-G1. LJ-G1 and LJ-Q2 had higher β-glucosidase-producing capacity than Aspergillus niger in 64 h of fermentation. The optimal fermentation conditions for β-glucosidase production were determined as follows: culture medium pH, 8.0; temperature, 38 ℃; and time, 38 h. The experimental value of β-glucosidase activity produced under the optimized conditions was 1.70 IU/mL. The fermentation process could convert 39.4% of soybean isoflavones into aglycones.

vegetarians; intestinal bacteria; β-glucosidase; fermentation conditions for β-glucosidase production

10.7506/spkx1002-6630-201607023

TS201.3

A

1002-6630(2016)07-0123-05

李笑梅, 馬慧玲. 兩株素食者腸道菌產β-葡萄糖苷酶考察及產酶條件優化[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 123-127.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607023. http://www.spkx.net.cn

LI Xiaomei, MA Huiling. Comparison of two β-glucosidase-producing strains from the intestinal tract of vegetarians and optimizaiton of fermentation conditions for β-glucosidase production[J]. Food Science, 2016, 37(7): 123-127. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607023. http://www.spkx.net.cn

2015-06-18

黑龍江省科技廳應用技術項目(G013B203);黑龍江省自然科學基金項目(C201201);黑龍江省高校科技創新團隊建設計劃項目(2010td04)

李笑梅(1960—),女,教授,本科,研究方向為食品科學。E-mail:lixm0451@163.com

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