以滸苔為碳源的地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化

王 穎，高 翔，周 君，張春丹，李 曄，王祖忠，袁 貝，戴 娟，錢琴蓮，蘇秀榕,

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.浙江省喬司監(jiān)獄，浙江 杭州 310019）

以滸苔為碳源的地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化

王 穎1，高 翔2，周 君1，張春丹1，李 曄1，王祖忠1，袁 貝1，戴 娟1，錢琴蓮1，蘇秀榕1,*

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.浙江省喬司監(jiān)獄，浙江 杭州 310019）

為了優(yōu)化地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）以滸苔（Enteromorpha prolifera）為碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的能力，以蛋白酶比活力為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)探討不同因素對(duì)產(chǎn)酶效率的影響，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出了3 個(gè)顯著因素：培養(yǎng)基初始pH值、滸苔添加量和NaH2PO4添加量。采用響應(yīng)面法對(duì)這3 個(gè)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳產(chǎn)酶條件為培養(yǎng)基初始pH 6.66、滸苔添加量4.65%、NaH2PO4添加量0.027 4%，此條件下蛋白酶比活力預(yù)測(cè)值為66 354.70 U/g pro，3 次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證值為66 966.37 U/g pro。驗(yàn)證值與基礎(chǔ)發(fā)酵條件下的最大蛋白酶比活力18 206.16 U/g pro相比，提高了2.68 倍。

地衣芽孢桿菌；滸苔；發(fā)酵條件；蛋白酶；Plackett-Burman設(shè)計(jì)

近年來，隨著全球氣候變化和水體富營(yíng)養(yǎng)化，赤潮、綠潮等頻頻暴發(fā)，嚴(yán)重影響了海洋及周邊的生態(tài)環(huán)境，威脅了養(yǎng)殖業(yè)和旅游業(yè)的發(fā)展[1]。滸苔（Enteromorpha prolifera）等綠潮在我國(guó)青島海域連續(xù)暴發(fā)，成為了全世界的研究熱點(diǎn)[2-5]。滸苔是一種繁殖迅速的大型綠藻，營(yíng)養(yǎng)豐富，高膳食纖維、低脂肪，且富含維生素、礦物質(zhì)等，滸苔干物質(zhì)中碳水化合物含量為43.3%～60.2%，蛋白質(zhì)含量為16.0%～22.1%，灰分含量為12.4%～18.7%[6]。碳水化合物是滸苔的主要成分[6]，利用滸苔作為發(fā)酵碳源，變廢為寶，是滸苔資源化利用的一個(gè)理想途徑。

蛋白酶是一種重要的工業(yè)酶制劑，在改善食品風(fēng)味、提高食品品質(zhì)等方面發(fā)揮著重要作用，是食品工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的酶[7-8]。本實(shí)驗(yàn)室從經(jīng)60Co輻照的東海香參中分離到一株能夠產(chǎn)堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[9]。與中性蛋白酶相比，堿性蛋白酶具有更強(qiáng)的水解能力和耐堿能力，有較強(qiáng)耐熱性且有一定的酯酶活力，更易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[10]。地衣芽孢桿菌是目前堿性蛋白酶的主要生產(chǎn)菌株之一[11]，優(yōu)化其發(fā)酵條件，提高其產(chǎn)酶能力，對(duì)工業(yè)擴(kuò)大化生產(chǎn)具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)以地衣芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，研究不同因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶能力的影響，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著效應(yīng)的因素，以滸苔為碳源，運(yùn)用響應(yīng)面分析法（response surface method，RSM）優(yōu)化發(fā)酵條件，旨在為地衣芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶工業(yè)擴(kuò)大化生產(chǎn)和滸苔的資源化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滸苔 福建福清市海興保健食品有限公司。

Folin-酚試劑、酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；干酪素 北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）CGMCC 4323寧波市健康食品與海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、保藏。

種子斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%、牛肉膏0.3%、NaCl 0.5%、瓊脂粉2.0%，自然pH值。種子液體培養(yǎng)基中不加瓊脂粉。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖7.500%、干酪素3.000%、NaCl 0.500%、K2HPO4·3H2O 0.530%、NaH2PO4·2H2O 0.030%、Na2CO30.056%、MnSO40.002%，自然pH值。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將－80 ℃保藏菌種劃線接入種子斜面培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后接一環(huán)于種子液體培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按6%接種量接種液體種子于本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的不同發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min發(fā)酵培養(yǎng)36 h。

1.3.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基水平上分別對(duì)碳源、氮源、金屬離子、初始pH值、接種量進(jìn)行單因素優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)次數(shù)為12 次的Plackett-Burman篩選試驗(yàn)，對(duì)滸苔添加量、酵母膏添加量、K2HPO4添加量、Na2CO3添加量、FeCl3添加量、NaH2PO4添加量、培養(yǎng)基初始pH值、接種量8 個(gè)因素進(jìn)行研究，篩選出有顯著效應(yīng)的關(guān)鍵因素。采用Box-Behnken原理設(shè)計(jì)對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的3 個(gè)關(guān)鍵因素：培養(yǎng)基初始pH值、滸苔添加量和NaH2PO4添加量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，以獲得較好的發(fā)酵條件。

1.3.3 分析方法

采用Folin-酚顯色法測(cè)定蛋白酶活力。蛋白酶活力單位定義為：在40 ℃、pH 10.0的條件下，1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。在本研究中，蛋白酶活力以酶比活力（U/g pro）表示。

菌體計(jì)數(shù)采用比濁計(jì)數(shù)法，以培養(yǎng)基為空白，測(cè)定OD560nm值。OD560nm值代表了菌體生物量，值越高表示菌體生物量越大。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6.1和SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基水平上，接種6%液體種子，每6 h取樣，測(cè)定OD560nm、pH值和酶比活力，結(jié)果見圖1。種子發(fā)酵6 h后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，30 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，36 h后菌體開始衰亡自溶，進(jìn)入衰亡期。發(fā)酵起始12 h，培養(yǎng)基pH值急劇下降到6.2，之后慢慢回升到6.7左右，36 h后pH值又開始下降。乳酸是地衣芽孢桿菌的主要代謝產(chǎn)物[12]，pH值在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期急劇下降，可能與有機(jī)酸的產(chǎn)生有關(guān)；之后回升可能是由于菌體的代謝途徑發(fā)生改變，有機(jī)酸在某些代謝途徑中被利用或者菌體自身生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制造成的。前6 h不產(chǎn)蛋白酶，24 h后大量產(chǎn)酶且在36 h時(shí)達(dá)到最大值，酶比活力為18 206.16 U/g pro，之后隨著菌體的衰亡，pH值的下降，酶比活力也急劇下降。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)酶的關(guān)系，可以把酶的生物合成模式分為同步合成、延續(xù)合成、中期合成和滯后合成4 種類型[13]。分析圖1中酶活力與細(xì)菌生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，在地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)一段時(shí)間后堿性蛋白酶開始進(jìn)行生物合成，并且當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后該酶還可以延續(xù)合成一段時(shí)間，因此可以推測(cè)地衣芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的生物合成屬于延續(xù)合成型，產(chǎn)物形成屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型，這一結(jié)果與馬永強(qiáng)等[13]研究地衣芽孢桿菌2709產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)獲得的結(jié)論一致。

圖1 蛋白酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Kinetic curves of protease activity and pH during fermentation

2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 碳源添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基水平上，以滸苔代替蔗糖作為碳源，滸苔添加量分別為2.5%、3.5%、4.5%、5.5%、6.5%、7.5%、8.5%、9.5%。滸苔添加量為4.5%時(shí)酶比活力最高，為53 469.64 U/g pro，與基礎(chǔ)發(fā)酵最大酶比活力18 206.16 U/g pro相比提高了1.94 倍（圖2），由此可見，滸苔比蔗糖更有利于地衣芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶。地衣芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的生物合成屬于延續(xù)合成型，這種生物合成類型能夠受到誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)作用，而滸苔干物質(zhì)中蛋白質(zhì)的含量較高（16.00%～22.10%）[5]，因此滸苔可能對(duì)蛋白酶的合成起到了誘導(dǎo)作用。同時(shí)，滸苔中纖維素（13.30%）與半纖維素（28.01%）的含量較高[14]，推測(cè)該菌株地衣芽孢桿菌主要以滸苔中的纖維素、半纖維素物質(zhì)作為碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，其胞外酶可能含纖維素酶，但其酶活性、降解纖維素的能力及滸苔作為碳源的利用效率還有待研究。另外，滸苔中氨基酸含量豐富，為13.30%（以干樣計(jì)），且種類齊全，主要包括天冬氨酸（1.52%）、苯丙氨酸（0.71%）、賴氨酸（0.68%）、亮氨酸（1.22%）、異亮氨酸（0.58%）、蘇氨酸（0.75%）、絲氨酸（0.74%）、組氨酸（0.22%）等[15]。這些氨基酸對(duì)地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，尤其是賴氨酸，不僅有利于生長(zhǎng)，而且具有特殊的刺激生長(zhǎng)作用，可視為生長(zhǎng)因子[12]，這也可能是滸苔作為碳源能夠大大提高地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶的原因之一。

圖2 滸苔添加量對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of E. prolifera concentration on protease activity

2.2.2 氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基水平上，分別添加3%的干酪素、牛肉膏、酵母膏、大豆蛋白、明膠、尿素、硝酸銨和蛋白胨作為氮源。圖3a表明，不同氮源對(duì)產(chǎn)酶影響有較大差異，本實(shí)驗(yàn)中有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更利于發(fā)酵產(chǎn)酶，尤其添加酵母膏作為氮源時(shí)蛋白酶比活力最高，為48 583.78 U/g pro，其次是大豆分離蛋白、明膠和尿素，添加硝酸銨和蛋白胨時(shí)蛋白酶比活力為0 U/g pro。孫倩等[16]對(duì)地衣芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的研究表明，以豆粕和磷酸銨混合物作為氮源時(shí)酶活最高，有機(jī)氮源與無機(jī)氮源的組合可以更充分地為菌種提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本研究?jī)H對(duì)單一氮源的選擇進(jìn)行了初步篩選，不同氮源組合的篩選有待研究。

進(jìn)一步研究酵母膏添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，酵母膏添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%。酵母膏添加量為4%時(shí)酶比活力最高，為57 699.15 U/g pro，與基礎(chǔ)發(fā)酵最大酶比活力18 206.16 U/g pro相比提高了2.17 倍（圖3b）。

圖3 不同氮源及酵母膏添加量對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources and yeast extract concentration on protease activity

2.2.3 金屬離子對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基水平上，添加0.002%不同金屬離子。由圖4可知，添加Fe3+時(shí)酶比活力最高，為55 007.92 U/g pro，與基礎(chǔ)發(fā)酵最大酶比活力18 206.16 U/g pro相比提高了2.02 倍，其次是Li+和Ba2+，添加Mg2+酶比活力最低。這表明Fe3+對(duì)地衣芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶有促進(jìn)作用。

圖4 不同金屬離子對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of different metal ions on protease activity

2.2.4 初始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基水平上，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為5、6、7、8、9、10、11、12。由圖5可知，初始pH值為7時(shí)酶比活力最高，為58 651.32 U/g pro，與基礎(chǔ)發(fā)酵最大酶比活力18 206.16 U/g pro相比提高了2.22 倍。pH值繼續(xù)增大時(shí)，酶比活力逐漸降低，說明在中性培養(yǎng)基條件下地衣芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力較高。這一結(jié)果與劉海進(jìn)[17]、卜令軍[18]等在地衣芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶培養(yǎng)條件優(yōu)化中確定的初始pH值為6.5～7.5一致，說明中性培養(yǎng)基條件下能夠穩(wěn)定維持菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶效率。

圖5 初始pH值對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of initial medium pH on protease activity

2.2.5 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖6 接種量對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.6 Effect of inoculum amount on protease activity

分別接種2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%的培養(yǎng)12 h種子培養(yǎng)基于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中。由圖6可知，接種量為12%時(shí)酶比活力最大，為57 854.18 U/g pro，與基礎(chǔ)發(fā)酵最大酶比活力18 206.16 U/g pro相比提高了2.18 倍。隨后蛋白酶比活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)榻臃N量增大，菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)間較早，培養(yǎng)基中菌體含量過多，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)成分不能滿足菌體正常生長(zhǎng)代謝，從而影響了產(chǎn)蛋白酶能力。

2.3 Plackett-Burman篩選試驗(yàn)

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表1。從顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（表2）可以看出，各影響因素的顯著性排序?yàn)椋撼跏紁H值＞滸苔添加量＞NaH2PO4添加量＞K2HPO4添加量＞FeCl3添加量＞接種量＞酵母膏添加量＞Na2CO3添加量。其中，初始pH值、滸苔添加量和NaH2PO4添加量對(duì)蛋白酶比活力的影響最為顯著。因此，選取這3 個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)一步作響應(yīng)面分析。其他因素根據(jù)單因素試驗(yàn)和節(jié)約成本的原則，將其水平控制在較好水平。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n=8）Table 1 Plackett-Burman design with experimental values of protease activity （n= 8）

表2 回歸方程顯著性檢驗(yàn)Table 2 Significance test of regression equation

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，得到二次多元回歸模型為：

該方程表達(dá)了蛋白酶比活力（Y）與3 個(gè)自變量間X1、X2、X3的關(guān)系。回歸方程的一次項(xiàng)和平方項(xiàng)系數(shù)都較大，說明響應(yīng)值與試驗(yàn)因子之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系；而交互項(xiàng)系數(shù)較小，說明響應(yīng)面分析所選3 個(gè)因素間的交互效應(yīng)較小。變量的正系數(shù)表明該變量的正向變化可引起響應(yīng)值的增加；負(fù)的二次項(xiàng)系數(shù)表明方程的拋物面開口向下，具有極大值點(diǎn)，能夠進(jìn)行最優(yōu)分析。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 3 RSM Design with experimental values of protease activity

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

回歸模型的方差分析見表4。決定系數(shù)R2為0.991 6，模型的P值小于0.01，說明該模型回歸方程極顯著，不同的試驗(yàn)因子之間差異高度顯著，該試驗(yàn)方法是可靠的。失擬項(xiàng)的P值為0.947 2＞0.05，差異不顯著，表明回歸模型擬合程度較好，可用于試驗(yàn)分析和預(yù)測(cè)。

響應(yīng)面三維圖是回歸方程的圖形表述，可從圖中直觀快速地找到最佳參數(shù)、參數(shù)之間的相互作用以及最大的響應(yīng)值[19]，從圖7上可以形象地看出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。隨著初始pH值的提高、滸苔添加量的增加、NaH2PO4添加量的增加，蛋白酶比活力都呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。響應(yīng)面曲面坡度陡峭，表明各因素對(duì)酶活力的影響較大；等高線呈現(xiàn)橢圓型，各圖的兩因素交互作用明顯。結(jié)果表明在中心點(diǎn)附近存在最大響應(yīng)值。

圖7 初始pH值、滸苔添加量、NaH2PO4添加量3 個(gè)因素間交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots for the effects of initial medium pH，Enteromorpha prolifera concentration and NaH2PO4concentration on protease activity

對(duì)二次回歸方程求解，當(dāng)響應(yīng)值Y最大時(shí)各因素的水平分別為X1=－0.17、X2=0.14、X3=－0.13，轉(zhuǎn)換后得最佳發(fā)酵條件為初始pH 6.66、滸苔添加量4.65%、NaH2PO4添加量0.027 4%，此條件下的理論預(yù)測(cè)蛋白酶比活力為66 354.70 U/g pro。為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的可靠性，按照最優(yōu)條件進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際測(cè)得的蛋白酶比活力平均值為66 966.37 U/g pro，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.9%。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

本研究通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法相結(jié)合，確定了地衣芽孢桿菌發(fā)酵滸苔產(chǎn)堿性蛋白酶的最佳條件為初始pH 6.66、滸苔添加量4.65%、NaH2PO4添加量0.027 4%，此條件下的蛋白酶比活力預(yù)測(cè)值為 66 354.70 U/g pro，3 次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證平均值為 66 966.37 U/g pro，驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值基本相符，且與基礎(chǔ)發(fā)酵最大蛋白酶比活力18 206.16 U/g pro相比，驗(yàn)證值提高了2.68 倍，地衣芽孢桿菌的產(chǎn)酶能力得到了顯著提高。

很多研究表明，滸苔含有生物活性物質(zhì)，具有顯著的藥理活性，如降血脂[20-21]、抗氧化[21-22]、提高免疫力[22-24]和抑制皮膚癌[25]等。本研究在獲得蛋白酶的同時(shí)還獲得了主要成分為滸苔殘?jiān)偷匾卵挎邨U菌的發(fā)酵副產(chǎn)物，若能夠?qū)Ω碑a(chǎn)物的具體成分進(jìn)行分析并充分發(fā)掘其生理功能，尋求提高其高值綜合利用途徑，將大大提高經(jīng)濟(jì)效益，并更好地服務(wù)于創(chuàng)建資源節(jié)約型社會(huì)，因此，發(fā)酵副產(chǎn)物的成分及生理活性功能也值得今后進(jìn)一步探討研究。

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Optimization of Fermentation Conditions for Protease Production by Bacillus licheniformis with Enteromorpha prolifera as Carbon Source

WANG Ying1, GAO Xiang2, ZHOU Jun1, ZHANG Chundan1, LI Ye1, WANG Zuzhong1, YUAN Bei1, DAI Juan1, QIAN Qinlian1, SU Xiurong1,*
(1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Qiaosi Prison in Zhejiang, Hangzhou 310019, China)

This work reports on the selection and optimization of culture conditions and medium components as well as their levels for improved production of protease by Bacillus licheniformis with Enteromorpha prolifera as a carbon source by the combined use of single factor method, Plackett-Burman design and response surface methodology (RSM). Initial medium pH, Enteromorpha prolifera concentration and NaH2PO4concentration were identified as the most significant factors that influence protease production. The levels of the three factors were optimized using RSM to be 6.66， 4.65% and 0.027 4%, respectively. Under the optimized conditions, the predicted values of protease activity was 66 354.70 U/g protein and an average value of 66 966.37 U/g protein was obtained from three replicate experiments, which was 3.68 times higher than that before optimization.

Bacillus licheniformis; Enteromorpha prolifera; fermentation conditions; protease; Plackett-Burman design

10.7506/spkx1002-6630-201607022

Q939.9

A

1002-6630（2016）07-0117-06

王穎, 高翔, 周君, 等. 以滸苔為碳源的地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 117-122.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607022. http://www.spkx.net.cn

WANG Ying, GAO Xiang, ZHOU Jun, et al. Optimization of fermentation conditions for protease production by Bacillus licheniformis with Enteromorpha prolifera as carbon source[J]. Food Science, 2016, 37(7): 117-122. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607022. http://www.spkx.net.cn

2015-10-01

國(guó)家科技星火計(jì)劃項(xiàng)目（2010GA701063）；浙江省重點(diǎn)社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2009C03017-1）

王穎（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：plyinger@126.com

*通信作者：蘇秀榕（1956—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程/生化與分子生物學(xué)。E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn