騰 飛,鄭 悅,王 萍
(東北林業大學林學院,黑龍江 哈爾濱 150040)
龍葵果花色苷的分離與鑒定
騰 飛,鄭 悅,王 萍*
(東北林業大學林學院,黑龍江 哈爾濱 150040)
采用硅膠柱層析技術分離制備龍葵果花色苷。分離得到的2 個花色苷餾分經紫外-可見光譜、高效液相色譜-電噴霧串聯質譜(high performance liquid chromatography electrosprary ionization-mass spectrometry,HPLC-DADESI-MS/MS)進行結構鑒定,并結合酸水解分析糖苷種類。最終確定餾分Ⅰ為飛燕草素-3-琥珀酰阿拉伯糖苷,根據峰面積歸一化法計算其純度為94%;餾分Ⅱ為矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-乙酰半乳糖苷,峰面積歸一化法計算其純度分別為45.67%和13.97%。
龍葵;花色苷;分離;鑒定;高效液相色譜-電噴霧質譜聯用;酸水解
龍葵(Solanum nigrum L.)為一年生草本植物,屬于茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum),又名黑星星、黑呦呦、黑天天、野葡萄等。龍葵全草高30~120 cm,白色聚傘花序,球形漿果,其果實未成熟時為綠色,成熟后為黑紫色[1]。龍葵全草含礦物質、氨基酸、維生素等營養成分,還含有苷類甾體生物堿、多糖、酯、酚類化合物和皂苷等活性成分[2]。龍葵在全國范圍內均有分布,且已有成熟的栽培技術。成熟的龍葵果含有豐富的紅色素,是一種極具開發價值的資源[3]。龍葵全草均可入藥,研究發現龍葵具有抗腫瘤,抗菌和抗病毒,抗炎與抗休克等功能,同時還對神經系統和泌尿系統有藥理作用[4]。
目前對龍葵的研究大多集中在對龍葵生物堿和多糖的研究[5],而對龍葵色素的研究起步較晚。目前已開展了對該色素提取及穩定性方面的研究,張賀等[6]通過正交試驗確定龍葵果紅色素提取最優工藝,建立了以提取溫度、提取時間為影響因素的提取龍葵果紅色素影響因素統計模型。范翠麗等[7]研究了常溫提取、水浴鍋熱提取、微波輔助提取和超聲波輔助提取對龍葵果色素的影響,并對龍葵果紅色素的浸提條件及浸提方法進行了系統研究,篩選出龍葵果紅色素的最佳提取方法及工藝條件。木合塔爾·吐爾等[8]研究了戈壁野生龍葵果紫紅色素的提取條件和理化性質,得出該色素在酸性條件下具有較好的穩定性,并且對光、熱和常用食品添加劑都比較穩定。然而對于龍葵花色苷的成分及結構還未見報道,本實驗利用柱層析將龍葵果花色苷分離,并采用高效液相色譜-電噴霧串聯質譜聯用儀(high performance liquid chromatography electrosprary ionization-mass spectrometry,HPLC-DAD-ESI-MS/MS)對分離得到的龍葵果花色苷分子質量和分子結構進行鑒定,為開發和綜合利用龍葵資源提供理論依據。
1.1 材料與試劑
龍葵果于2014年9月采于東北農業大學校園內,采摘的新鮮龍葵果于-18 ℃冷凍保藏。
甲醇(色譜純) 美國Fisher公司;純凈水 娃哈哈集團;D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖、L-阿拉伯糖(色譜純) 上海源葉生物技術有限公司;柱層析硅膠(200~300 目) 青島海洋化工廠;X-5大孔樹脂 南開大學化工廠;其他試劑均為國產分析純。
1.2 儀器與設備
Agilent1100型高效液相色譜-電噴霧質譜聯用儀、Agilent1260型高效液相色譜儀(配有示差折光檢測器)、Agilent Plus C18色譜柱(150 mmh3.0 mm,1.8 μm) 美國安捷倫公司;氨基柱(250 mmh 4.6 mm,5.0 μm) 美國Waters公司;薄層層析板(5 cmh20 cm) 青島海洋化工廠;玻璃層析柱(1.0 cmh40 cm)、HL-2型恒流泵 上海精科試業有限公司。
1.3 方法
1.3.1 樣品的制備
[5,9],準確稱取龍葵鮮果,按1∶25的料液比(m/V)用pH1.0,體積分數為60%的乙醇室溫浸提3 次,每次2 h。合并濾液,真空旋轉濃縮除去乙醇,過X-5大孔吸附樹脂,用蒸餾水洗脫以除去糖、氨基酸等物質,用手持糖量計檢測無可溶性固形物后再用pH 2.0,體積分數為60%的乙醇洗脫,收集洗脫液,減壓濃縮后得龍葵果花色苷精制物,冷藏備用。
1.3.2 展開劑的篩選
分別在11 種展開系統中進行薄層層析實驗,選擇適合分離龍葵果花色苷的展開劑系統,展開劑系統的組成見表1。

表1 不同展開劑的組成Table 1 Composition of different developers
1.3.3 硅膠柱層析分離龍葵果花色苷
稱取25.0 g硅膠濕法裝柱,濕法上樣后用薄層層析選擇的最佳展開劑進行洗脫,分別收集不同顏色的洗脫液,利用薄層層析檢驗相同餾分并合并,40 ℃條件下減壓旋轉蒸發將溶劑旋出[10]。
1.3.4 高效液相色譜條件
將分離得到的餾分真空濃縮后用體積分數為0.1%冰乙酸甲醇溶液溶解后,過0.45 μm濾膜。參照Simirgiosts等[11]的方法并做適當修改,得到色譜條件為:Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mmh3.0 mm,1.8 μm);流動相A:0.1%冰乙酸溶液,流動相B:甲醇;洗脫流速為0.4 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量5 μL。線性梯度洗脫條件:0~3 min,10%~50% B;3~5 min,50%~85% B;5~8 min,85%~10% B;9~12 min,10% B等度洗脫。
1.3.5 質譜條件
參照Lee等[12]的方法并做適當修改,采用HPLCDAD-ESI-MS/MS技術電噴霧電離離子源(electrospray ionization,ESI),霧化氣壓35 psi;干燥氣體氮氣流速10.0 L/min;干燥氣體溫度300 ℃;毛細管電壓4 000 V;碎裂電壓110 V;碰撞能量5~45 V;采用正離子模式,在m/z 100~1 000范圍內掃描。
1.3.6 花色苷的糖苷類型分析
將分離得到的花色苷餾分溶解于2 mol/L的HCl中,100 ℃回流提取2 h,得到棕色溶液后,用異戊醇萃取直至水層無色[13]。異戊醇層為花色苷苷元,水層則為水解得到的糖苷。將水解得到的糖苷濃縮后用乙腈溶解并過0.45 μm濾膜。用配有示差折光檢測器的Agilent1260型高效液相色譜儀分析。色譜條件為:Waters氨基柱(250 mmh4.6 mm,5.0 μm),柱溫35 ℃,流動相為乙腈-水(75∶25,V/V),流速1.0 mL/min,進樣量20 μL。用質量濃度均為10.0 mg/mL的D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖和L-阿拉伯糖溶液做標準品[14]。
1.3.7 糖苷鍵位置的測定
取適量分離得到的花色苷餾分,以相應展開劑做空白,用紫外分光光度儀于200~700 nm進行光譜掃描,測其最大吸收峰和在440 nm波長處的吸光度,計算

圖1 餾分Ⅰ紫外吸收光譜圖Fig.1 UV spectrum of fraction Ⅰ
2.1 展開劑的篩選結果與分析
實驗選擇常見花色苷的展開體系對龍葵果花色苷進行分離,結果如表2所示。

表2 不同展開劑的展開效果Table 2 Efficiency of different developers
由表2可知,BAW3(V(正丁醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)=4∶1∶3)為最優展開劑。用薄層色譜法分離龍葵果花色苷時,用BAW3展開出現3 條色帶,各色帶在色譜上的比移值(Rf)見表3。

表3 龍葵果花色苷薄層色譜分離的Rf值Table 3Rf values of Solanum nigrum L. anthocyanins
由表3可知,中間色帶和下色帶為主要花色苷,上色帶顏色很淺表現為黃色,經檢驗為非花色苷物質,因此不做進一步研究。
2.2 最大吸收波長的確定
將硅膠柱層析分段洗脫得到的餾分薄層層析點樣,合并相同餾分后得到餾分Ⅰ和餾分Ⅱ。對餾分Ⅰ和餾分Ⅱ做紫外全波長掃描。由圖1、2可知,餾分Ⅰ的最大吸收波長在547 nm和321 nm處,餾分Ⅱ的最大吸收波長在525 nm和315 nm處。兩個花色苷餾分均在300~330 nm處有吸收峰,說明花色苷分子內有酰基[15]。

圖2 餾分Ⅱ紫外吸收光譜圖Fig.2 UV spectrum of fraction Ⅱ
2.3 HPLC-DAD-ESI-MS/MS檢測結果與分析
餾分Ⅰ經過HPLC-DAD-ESI-MS/MS分析得到總離子流圖和質譜圖。由圖3可知,餾分Ⅰ共有3 個峰,峰1和峰2經質譜分析為非花色苷類物質,峰3為花色苷類物質。

圖3 餾分Ⅰ的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of fraction Ⅰ
由圖3可知,餾分Ⅰ只有一個主要峰(峰3),出峰時間為2.09 min,峰面積為3 607,峰面積歸一化法計算得出峰3占餾分Ⅰ含量為94%。由圖4a可知,該物質的分子離子峰[M+H]+的質荷比(m/z)為537,由圖4b可知其中一個碎片離子的m/z為436,二者相差一個質荷比為100的基團,根據da Silva等[16]研究該基團為琥珀酸。此外圖1顯示餾分Ⅰ在321 nm處有一個尖峰,Escribano-Bailón等[15]研究認為若花色苷分子有酰化基團,則在300~330 nm處會存在一個尖峰。另一個碎片離子[M+H]+的m/z為304對應6種花色素中的飛燕草素,與碎片離子m/z 436相比又丟失了一個m/z為132的基團,即為戊糖苷,由此推斷該物質為飛燕草素的衍生物,可能是飛燕草素-3-琥珀酰戊糖苷[16]。

圖4 餾分Ⅰ的質譜圖Fig.4 Molecular ion and fragment ion mass spectra of fraction I

圖5 餾分Ⅱ的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of fraction Ⅱ
餾分Ⅱ經HPLC-DAD-ESI-MS/MS分析得到總離子流圖和質譜圖。由圖5可知,該餾分有3 種物質,分別為峰1、峰2、峰3,出峰時間分別為3.05、3.97、6.78 min。其中峰1經紫外全波長掃描和二級質譜分析后顯示為非花色苷類物質,因此不做進一步的研究。


圖6 餾分Ⅱ的質譜圖Fig.6 Molecular ion and fragment ion mass spectra of fraction Ⅱ
由圖5可知,峰2的出峰時間為3.97 min,峰面積歸一化法計算得出相對餾分Ⅱ含量為45.67%,由圖6a可知,該物質分子離子峰[M]+的m/z為449,圖6b顯示其碎片離子峰[M]+的m/z為287,二者相差162,為己糖脫去一分子水所得,這是典型的矢車菊素-3-己糖苷的質譜信息[17-18]。峰3的出峰時間為6.78 min,峰面積歸一化法計算得出相對餾分Ⅱ含量為13.97%,由圖6c可知,此物質分子離子峰[M]+的m/z為492,碎片離子的m/z為287,表明該物質為矢車菊素的衍生物,二者m/z相差205為乙酰己糖脫去一分子水所得,因此推斷該物質為矢車菊素-3-乙酰己糖苷[18],在315 nm波長處檢測的尖峰也證實了酰基的存在[19]。
2.4 花色苷糖苷類型的分析

圖7 餾分Ⅰ糖苷(a)與阿拉伯糖(b)的色譜圖Fig.7 HPLC-RID chromatogram of fraction Ⅰ (a) and arabinose (b)
市售的花色苷標準品種類不全,此外花色苷的不穩定性,導致購買標準品分析花色苷的組成可行性不大。因此,經常采用將其酸水解后,分別分析花色苷的苷元和糖苷的方法。由圖7、8可知,餾分Ⅰ中糖苷出峰時間為5.041 min,餾分Ⅱ中糖苷出峰時間為5.821 min。標準品的出峰時間分別為D-葡萄糖5.643 min、D-半乳糖為5.858 min、果糖5.288 min、L-鼠李糖4.442 min、D-甘露糖5.416 min、D-木糖4.806 min、L-阿拉伯糖5.089 min。由此推測餾分Ⅰ攜帶的糖苷為L-阿拉伯糖,餾分Ⅱ所攜帶糖苷為D-半乳糖。

圖8 餾分Ⅱ糖苷(a)與半乳糖(b)的色譜圖Fig.8 HPLC-RID chromatogram of fraction Ⅱ (a) and galactose (b)
2.5 花色苷糖苷鍵位置的確定
餾分Ⅰ和餾分Ⅱ的A440nm/Amax分別為18.5%和25%,證明糖苷鍵的位置在C3位[20]。該糖基可與有機酸發生酰化反應,常見的芳香酸有p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、沒食子酸或p-羥基苯甲酸;脂肪酸有丙二酸、醋酸、蘋果酸、琥珀酸或草酸等。這些酸通常與C環3位上糖基的6位羥基或者少數也與4位羥基發生酰化[21]。因此,推斷餾分Ⅰ為飛燕草素-3-琥珀酰阿拉伯糖苷,餾分Ⅱ包含2 種花色苷,分別為矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-乙酰半乳糖苷。
花色苷作為替代化學合成的食品著色劑已經受到了社會各界的高度關注,然而,花色苷在食品加工、運輸和貯藏過程中所表現出的極不穩定性限制了其在食品工業中的應用。研究顯示酰化的花色苷在pH值變化、溫度升高和光照存在時表現出了比非酰化的花色苷更好的穩定性[21]。因此,酰化的花色苷有著更加廣泛的應用[22]。酰化的花色苷廣泛存在于水蘿卜、紅薯、紫甘薯、紅甘藍和黑胡蘿卜中。Correa-Betanzo等[23]分析了野生藍莓中的12 種花色苷,結果僅有2 種為酰化的花色苷。Wu Xiangyang等[24]在桑葚中分離得到4 種花色苷,僅有1 種為酰化的花色苷。在草莓和紅樹莓中則不存在酰化的花色苷[25-26]。而本實驗則找到了一種富含酰化花色苷的來源廣泛價格低廉的植物原料。
經硅膠柱層析分離得到2 個花色苷餾分,通過HPLCDAD-ESI-MS/MS分析,餾分Ⅰ為單體花色苷,峰面積歸一化法計算得出純度為94%,推斷為飛燕草素-3-琥珀酰阿拉伯糖苷;餾分Ⅱ包含2 種花色苷分別為矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-乙酰半乳糖苷,峰面積歸一化法計算二者總含量占餾分Ⅱ的59.64%。此分離方法簡便易行,為龍葵的精深加工提供了實驗依據。
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Isolation and Identification of Anthocyanins from Solanum nigrum L. Fruits
TENG Fei, ZHENG Yue, WANG Ping*
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)
The objective of this study was to isolate anthocyanins from Solanum nigrum L. fruits by silica gel column chromatography and identify them by UV-visible spectroscopy and high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Acid hydrolysis was applied for the identification of glucosides. Three anthocyanins were identified for the first time in Solanum nigrum L. fruits. Only delphinidin-3-succinylarabinoside was detected in fraction I (the purity was 94%), while both cyanidin-3-galactoside (the purity was 45.67%) and cyanidin-3-acetylgalactoside (the purity was 13.97%) were found to be present in fraction II. The presented method is simple and reliable to isolate and identify the anthocyanins from Solanum nigrum L. fruits.
Solanum nigrum L.; anthocyanins; isolation; identification; high performance liquid chromatography electrosprary ionization-mass spectrometry (HPLC-DAD-ESI-MS/MS); acid hydrolysis
10.7506/spkx1002-6630-201607011
TS201.1
A
1002-6630(2016)07-0056-06
騰飛, 鄭悅, 王萍. 龍葵果花色苷的分離與鑒定[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 56-61. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607011. http://www.spkx.net.cn
TENG Fei, ZHENG Yue, WANG Ping. Isolation and identification of anthocyanins from Solanum nigrum L. fruits[J]. Food Science, 2016, 37(7): 56-61. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607011. http://www.spkx.net.cn
2015-05-11
黑龍江省卓越農林人才教育培養計劃改革試點項目(41110211)
騰飛(1990—),女,碩士,研究方向為功能食品。E-mail:tengfeisiyu@126.com
*通信作者:王萍(1964—),女,教授,博士,研究方向為植物活性成分提取及功能。E-mail:wangpingnefu@126.com