酶聯免疫法測定水中氯霉素的方法探討

劉 靜， 董煜杰， 嚴義勇

(1. 成都市自來水有限責任公司水質中心 ，四川成都610071；2. 深圳市易瑞生物技術有限公司，廣東深圳518000)

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分 析 監 測

酶聯免疫法測定水中氯霉素的方法探討

劉 靜1， 董煜杰1， 嚴義勇2

(1. 成都市自來水有限責任公司水質中心 ，四川成都610071；2. 深圳市易瑞生物技術有限公司，廣東深圳518000)

氯霉素藥物在水產及畜牧業使用廣泛，相關的行業用水及抗生素生產廢水會在水域中殘留，若被人體長期攝取，會造成被動的抗生素濫用，嚴重影響民眾身體健康水平，因此水中氯霉素的檢測需要引起重視。開發了一種針對水樣品中氯霉素的快速檢測方法。通過比較確定氮吹法為最優的前處理方法，并得到了較高的檢測靈敏度(25 ng/L)。本研究為ELISA法在水質檢測中的應用提供了一個范例，給水源污染應急檢測提供一個快速檢測方案。

酶聯免疫法； 氯霉素； 凍干； 氮吹

酶聯免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)自1971年建立以來，由于其極高的靈敏度、特異性及適用性，已成為生物及分析化學領域的前沿課題[1]。目前此法在醫學、檢測食品藥物殘留方面有廣泛成熟的應用，而在水質檢測中報導較少。形成這種情況的重要原因之一是ELISA研發過程中的樣品處理方式不適用于水質樣本檢測。

氯霉素屬廣譜類抗生素藥物，能抑制尤其是革蘭氏陰性菌細菌蛋白質的合成，對各種立克氏體、原蟲及部分病毒也有一定的抑制作用[2]。目前氯霉素類藥物在水產和畜禽養殖中仍應用廣泛，添加氯霉素的水產養殖水和抗生素制藥廠偷排的廢水是環境中氯霉素的來源。因此氯霉素的環境污染，尤其是水域中的污染是值得重視的問題[3]。目前檢測氯霉素方法包括高效液相色譜法[4-5]、氣相色譜法[6]、質譜法[7-9]等，其分析時間長、樣品前處理復雜、需要昂貴的儀器且對操作人員技能有很高的要求。

本文將探索酶聯免疫法如何與適合的樣品前處理技術結合，以氯霉素(Chloramphenicol)為目標物，測定水中的氯霉素含量。而ELISA方法不但有極高的特異性、準確度和靈敏度，還具有檢測速度快、同時檢測大量樣本、方便易用的特點。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：氯霉素標準溶液100 μg/mL(甲醇溶劑，國家標準物質中心)、乙腈(色譜純)、乙酸乙酯(色譜純)、甲醇(色譜純)，Milli-P超純水，氯霉素檢測試劑盒(深圳市易瑞生物技術有限公司)。

儀器：Thermo Multiskan FC 96孔酶標儀(配備450和630 nm濾光片)；Eppendorf 5702離心機(轉速4 000 r/min)；Denver Instrument 天平(感量0.00 001 g)；IKA MS3 basic渦旋儀；氮氣吹干儀；Thermo finnpippete移液器：單道10～100 μL、100～1 000 μL、多道30～300 μL。

1.2 試驗方法

1.2.1 準備

使用試劑盒前將試劑和微孔板回溫至室溫，用后放回2～8 ℃。取出需要數量的微孔板，其余的放入自封袋中，保存于2～8 ℃。建議每個樣品和標準液做2次平行試驗。

1.2.2 加樣

加入標準品/樣品50 μL 到相應微孔，然后加入酶結合物50 μL 到每個微孔，最后加入抗體工作液50 μL 到每孔，輕輕震蕩混勻后，蓋上蓋板膜。

1.2.3 孵育

室溫25 ℃下避光反應30 min。

1.2.4 洗板

小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加1×洗滌液250 μL/孔，重復洗滌5 次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干。

1.2.5 顯色

每孔依次加入底物液A 50 μL，底物液B 50 μL，輕輕震蕩混勻后，蓋上蓋板膜，25 ℃室溫下避光反應15 min。

1.2.6 終止和讀值

加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處(用雙波長450/630 nm檢測，在5 min內讀完數據)，測定每孔OD值。

1.2.7 樣品處理方法

取1 mL水樣于1.5 mL離心管中；采樣不同的富集方式進行濃縮；加入樣本復溶液0.2 mL，渦旋震蕩5 min 后用于點樣(樣本稀釋倍數為0.2 倍)。

1.3 計算方法

標準品和樣品的平均吸光度值(平均OD值)除以零標準的平均吸光度值(平均OD值)，再乘以100。零標準為100%(最大吸光度值)，其他OD值為最大吸光度的百分數。

說起“現成品藝術”，很容易讓人聯想到馬歇爾.杜尚的一系列作品，比如《自行車輪》、《泉》、《大玻璃》、《L.H.O.O.Q》等。但在理論家阿瑟.丹托(ArthurC Danto)的著作《藝術的終結》一書中，丹托并沒有將杜尚的《泉》作為一件標志“藝術終結”的作品，而是選擇了安迪.沃霍爾(Andy Warhol)的《布里洛盒子》。這兩件作品看上去都跟現成品有關，為什么丹托不選擇更早出現的《泉》呢？

式中B——標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0——0ppb標準溶液的平均吸光度值

校準曲線以log(標準品濃度)為橫坐標，以Logit(B/B0)為縱坐標，構建線性回歸方程。將樣品的Logit(B/B0)值代入上述回歸方程，求得的值乘以樣本稀釋倍數0.2，即為樣本中氯霉素含量。

2 結果與分析

2.1 水中氯霉素的富集

2.1.1 富集方式的選擇

水中痕量抗生素富集方法可以用凍干法或氮吹濃縮富集法。凍干法是取1mL水樣品，冷凍成冰干燥過夜后再測定。

選取了新鮮制備的雙蒸水作為陰性樣本。通過在1mL陰性樣本中添加不同量的氯霉素，對兩種方法進行回收率對比實驗，結果見表1。

表1 不同方法回收率測定

對比試驗表明凍干法回收率略高于氮吹法。凍干法可很好地實現水溶液中氯霉素的富集，但操作時間過長(16 h以上)，且需要配備凍干機。氮吹濃縮時間較短，試驗回收率也能滿足回收率>70%的檢測要求。本次選用氮吹濃縮進行水中氯霉素的富集。

2.1.2 富集用有機溶劑的選擇

因水相對常用有機溶劑來說沸點較高，不易吹干，需通過往水中摻和有機溶劑形成低沸混合物的方法來有效降低水的沸點，從而提高氮吹濃縮時效。

根據氯霉素的溶解性、有機溶劑與水的互溶性、共沸物形成情況等因素，選定乙腈作為水中氯霉素濃縮富集的有機溶劑。

2.1.3 富集用有機溶劑與水比例的選擇

1 mL水樣品中添加不同含量乙腈對濃縮干燥時間有一定影響。在78 ℃加熱， 1 mL水樣品中添加1，3，5，7，9和11 mL的乙腈，干燥時間如下表2所示。隨乙腈加量增加，干燥時間先降后升。當乙腈：水比例為9 ∶1時，所需時間最短，此時最接近乙腈-水共沸物(乙腈含量85%，共沸點76 ℃)[10]。故選用乙腈∶水(9 ∶1)作為富集用低沸混合溶劑。不同乙腈摻和量的樣品干燥時間如表2所示。

表2 不同乙腈摻和量的樣品干燥時間

2.2 試劑盒有效性復核

2.2.1 線性檢測

配置0，25，100，400和1 600 ng/L的5點標準點，繪制標準曲線，標準曲線的R2值為0.993，線性較好，符合檢測要求。氯霉素ELISA的標準曲線如圖1所示。

圖1 氯霉素ELISA的標準曲線

2.2.2 檢出限

以超純水為空白樣品，測定6個空白樣品的平均值，再加上3倍標準差，即為檢測限。配置0，25，100，400，1 600 ng/L的5點標準曲線(R2=0.993)，計算由上表可知檢測限為24.81 ng/L，與試劑盒檢出限標識相符。

表3 ELISA試劑盒空白樣品的測定及檢測限的核定

2.3 實際樣品測試

選取了具有代表性的5個出廠水和6個管網水點位的樣本進行了實際樣品檢測。5個出廠水，分別編號為：CC1，CC2，CC3，CC4，CC5；6個管網水，分別編號為GW1，GW2，GW3，GW4，GW5，GW6。平行測試3次，取平均值，測定結果如表4所示。

表4 ELISA法測定實際水樣中氯霉素的測定結果

3 結論

① 通過優化選擇，獲得了水質樣本ELISA檢測前處理的合適方法。將進一步提高ELISA檢測在水環境檢測中的應用前景。

② 氮吹-ELISA法的建立應用，大大提高了檢測時效，適合水質樣品的快速篩查定量。該方法對控制水質安全，應對突發性安全事件等水質監控具有重要意義。

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廣東省科技發展專項資金(2016A040403022)

O657

C

1673-9353(2016)05-0052-03

10.3969/j.issn.1673-9353.2016.05.012

劉 靜(1983- )， 女， 工程師， 主要從事水質微生物領域的檢測及研究工作。E-mail：joise028_912@163.com

2016-05-30