大鼠腦缺血再灌注后大腦海馬區自噬的研究

趙亞倩，黃國偉，陳　爽，茍　蕓，張緒梅

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大鼠腦缺血再灌注后大腦海馬區自噬的研究

趙亞倩，黃國偉，陳爽，茍蕓，張緒梅

目的檢測大鼠腦缺血再灌注后海馬神經細胞損傷及自噬變化，并比較海馬CA1及CA3區的自噬情況。方法用線栓法制作大鼠腦局部缺血再灌注模型，實驗動物隨機分為：對照組(Control組)、假手術組(Sham組)和大腦中動脈栓塞再灌注組(MCAO組)。HE染色檢測大鼠海馬神經細胞損傷。透射電鏡下觀察海馬神經元內自噬小體。免疫熒光法檢測自噬相關蛋白LC3、Beclin-1的表達水平。結果與Control組及Sham組比較，大鼠腦缺血再灌注后，海馬神經細胞損傷嚴重；海馬神經元內有自噬體形成；自噬標記物LC3、Beclin-1蛋白表達水平顯著增加，且CA1區的表達量明顯高于CA3區(差異均具有統計學意義P<0.05)。結論腦缺血再灌注可激活海馬神經細胞內的自噬,并進一步引起細胞損傷；模型動物海馬CA1區的自噬水平顯著高于CA3區，暗示CA1區對腦缺血損傷具有較高的敏感度。

缺血再灌注；自噬；海馬；LC3；Beclin-1

隨著社會人口的老齡化，作為老年病的卒中已經成為人類死亡的三大病因之一。卒中的病理機制報道有很多，其中涉及到缺血缺氧引起的細胞能量代謝障礙、興奮性氨基酸的神經毒性、胞內鈣超載、氧自由基和NO損傷以及炎癥反應等[1]。近年來研究發現自噬在腦梗死等中樞神經系統疾病病理過程中發揮著重要作用。自噬是細胞的一種高度保守降解途徑，通過隔離膜包裹細胞質和(或)細胞器等物質形成自噬體，再通過微管系統與溶酶體結合成自噬溶酶體，并降解包裹的物質[2]。國內外已有研究報道腦缺血后神經細胞內存在自噬現象[3,4]，但為了對疾病的發生發展有更深入的認識，尚需對其進一步進行定位、定量研究。

海馬是大腦中對缺血缺氧損傷極敏感的區域，已有研究證實海馬CA1區錐體神經元對缺血性損傷十分敏感，而CA3區和DG區則對缺血性刺激相對耐受[5]。這暗示腦缺血處理可能激活了海馬各亞區不同的分子機制[6]。國內外已有學者進行了腦缺血再灌注后海馬自噬情況的研究，但是這些研究大多僅針對海馬整個組織或CA1區[7,8]，對海馬CA1區和CA3區的對比研究鮮有報道。本實驗擬檢測大鼠腦缺血再灌注后海馬神經細胞的損傷及自噬情況，并比較海馬CA1及CA3區的自噬相關蛋白LC3、Beclin-1的表達水平，為腦缺血再灌注損傷機制的深入研究提供理論基礎。

1　材料和方法

1.1實驗動物與分組SPF級雄性SD大鼠60只，重量210～230 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物飼養合格證號:SCXK(京)2012-0001。按體重隨機分為對照組(Control組)、假手術組(Sham組)、大腦中動脈栓塞再灌注組(MCAO組)，每組20只。大鼠適應7 d后造模。再灌注24 h及72 h后處死大鼠取材。

1.2藥品與試劑兔抗大鼠Beclin-1多克隆抗體(abcam公司，貨號：ab55878)，兔抗大鼠LC3B多克隆抗體(CST公司，貨號：#2775)，FITC標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋科技有限公司)，檸檬酸鈉-EDTA抗原修復液及抗熒光淬滅封片劑(碧云天生物技術研究所)，即用型山羊血清(博士德生物)，其他常用試劑均為國產分析純。

1.3大腦中動脈栓塞再灌注模型的建立采用改良Longa法[9]制備大鼠大腦局灶性腦缺血再灌注模型，用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉大鼠，仰臥位固定于手術臺上，頸部正中縱向切口，逐層分離。暴露左側頸總動脈(common carotid artery，CCA)和迷走神經。鈍性分離CCA和迷走神經。找到左側頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內動脈(internal carotid artery，ICA)分叉，分離ECA，ICA，用縫合線結扎ECA近分叉端。在近心端和分叉前分別用動脈夾夾閉CCA，在距動脈分叉5 mm處用1 ml注射器針頭，扎開小口，插入栓線，松開分叉前動脈夾，栓線緩慢向ICA插入，繼續將栓線緩慢向ICA入顱方向推進，至有阻力不能再進為止，插線長度約18～20 mm(從分叉處算)。用縫合線將栓線與CCA結扎固定，松開近心端動脈夾。1 h后栓線拔出1 cm，剪短露在外面的栓線。手術過程中嚴格遵守無菌操作規范。術后大鼠放入鼠盒中(墊料經高壓處理)，白熾燈照射對其保溫，保持干燥，密切觀察。假手術組除不進線外，其余過程同模型組。

1.4神經功能評分按照Longa提出的5分制評分標準[9]。評分在1～3分為有效模型，0分和4分則剔除，模型在后續實驗中隨機補全，以保證每組動物數不變。

1.5電鏡切片制備再灌注24 h，每組隨機取3只大鼠斷頭取腦，冰上分離出梗死側海馬，將海馬切成1 mm3的小塊，迅速置于2.5%戊二醛中固定4 h，1%鋨酸后固定，常規梯度丙酮脫水，Epon812包埋，半薄切片選區，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，透射電鏡(HT-7700；Hitachi)下觀察。

1.6石蠟切片制備各組大鼠在相應時間點(再灌注24 h-免疫熒光，再灌注72 h-HE)水合氯醛麻醉下，經心臟灌注生理鹽水250 ml后，灌注300 ml 4%中性多聚甲醛。灌注后取出左側腦組織，4%的中性多聚甲醛固定過夜。梯度蔗糖脫水，常規石蠟包埋。將腦組織以梗死灶為中心冠狀切開，包括皮質、海馬等，連續切片，厚度為6 μm。

1.7HE染色各組隨機選取3只大鼠石蠟切片進行HE染色，每只大鼠取大腦梗死側冠狀切片(隔4取1)6張，光鏡(IX81；Olympus)下拍攝大鼠海馬照片。

1.8免疫熒光檢測依次進行脫蠟、水化、H2O2室溫封閉10 min、枸櫞酸抗原修復、山羊血清37 ℃封閉40 min、滴加一抗(LC3 1∶400，Beclin-1 1∶200)4 ℃過夜、相應二抗(山羊抗兔1∶100)25 ℃孵育1 h，抗熒光淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡(IX81；Olympus)下觀察并拍照。Image Pro Plus計數陽性細胞。

2　結　果

2.1病理形態學觀察HE染色結果顯示，缺血再灌注72 h后，Control組及Sham組大鼠大腦海馬神經細胞排列整齊，胞核大而圓。MCAO組神經細胞數量減少，排列紊亂，細胞間隙增寬，胞核固縮，可見腦缺血再灌注對神經細胞造成了明顯損傷。

2.2海馬神經元超微結構變化Control組及Sham組大鼠海馬神經元胞核呈圓形或橢圓形，核膜清晰完整，染色質呈細顆粒狀，均勻分布，胞漿內可見豐富的細胞器，線粒體呈橢圓形或桿狀，線粒體嵴發達，粗面內質網散在分布，可見大量游離核糖體。MCAO組神經元可見染色質呈團塊狀邊集于核膜下，線粒體腫脹，球形線粒體多見，線粒體嵴斷裂，粗面內質網囊性變，胞漿內游離核糖體明顯減少，可觀察到內腔包裹有吞噬物的游離雙層或多層膜結構(即自噬小體)，包裹的吞噬物為形態尚完好或已降解的細胞質或細胞器。

2.3缺血再灌注對自噬標記物LC3和Beclin-1蛋白表達的影響LC3免疫熒光結果顯示，缺血再灌注24 h后，Control組及Sham組大鼠腦海馬區有少量的LC3蛋白表達陽性細胞(呈綠色熒光)。與Control組及Sham組相比，MCAO組LC3陽性細胞顯著增多，差異有統計學意義(P<0.05)。將MCAO組海馬CA1區與CA3區LC3陽性細胞分別計數結果顯示，CA1區陽性細胞顯著多于CA3區，且差異有統計學意義(P<0.05)。Beclin-1免疫熒光結果顯示，缺血再灌注24 h后，Control組及Sham組大鼠腦海馬區有少量的Beclin-1蛋白表達陽性細胞(呈綠色熒光)。與Control組及Sham組相比，MCAO組Beclin-1陽性細胞顯著增多，差異有統計學意義(P<0.05)。將MCAO組海馬CA1區與CA3區Beclin-1陽性細胞分別計數結果顯示，CA1區陽性細胞顯著多于CA3區，且差異有統計學意義(P<0.05)。

3　討　論

自噬是機體清除過量、老化蛋白質及受損細胞器的重要途徑。適度的自噬是細胞完成自身代謝和細胞器更新的重要方式，對維持機體內環境穩定，以及調控細胞損傷和老化具有重要意義。多數研究認為自噬的過度激活可導致細胞程序性死亡，從而引起一系列疾病過程[10]。Koike等利用小鼠大腦缺血缺氧模型，發現海馬錐體細胞層有自噬體的形成及海馬神經元廣泛死亡，而自噬相關基因Atg7缺陷小鼠的神經元死亡顯著減少[11]，說明自噬的激活在神經元死亡過程中起重要作用。本研究我們采用大鼠MCAO模型發現腦缺血再灌注后海馬神經細胞損傷嚴重，且在神經細胞內觀察到較多的自噬小體，表明腦缺血再灌注激活了神經細胞內自噬，進而導致神經細胞的損傷，這與Koike等的報道一致。

自噬小體的形成可能涉及多種蛋白表達的改變，如LC3、Beclin-1、組織蛋白酶(Cathepsin)、P62蛋白及溶酶體相關蛋白等。研究發現，自噬的整個過程是由自噬相關基因(autophagy-related gene，Atg)家族調控。LC3是酵母菌自噬基因(Atg7/Atg8)在哺乳動物中的同源物，在自噬過程中與降解后的自噬小體膜的形成密切相關。Beclin-1作為酵母Atg6的同源物，可調控自噬前體和自噬體形成。強強等用四血管法制作大鼠全腦缺血再灌注模型，發現大鼠全腦缺血再灌注損傷后海馬自噬相關蛋白Beclin-1表達上調[7]。本研究用線栓法制作大鼠局部腦缺血再灌注模型，結果顯示，腦缺血損傷后海馬區LC3和Beclin-1蛋白表達均顯著提高，說明MCAO組電鏡觀察到的自噬小體的形成與腦損傷激活兩種蛋白表達有關。

CA1、CA3、DG是目前應用最多的海馬分區。已有研究證實海馬各區對缺血的敏感性存在較大差異，Schmidt-Kastner等發現在短暫的缺血處理后,CA1區的錐體神經元幾乎全部死亡，而CA3區、DG區神經元幾乎不受影響[5]，推測細胞內不同分子機制的激活可能造成缺血缺氧后細胞損傷程度的差異。本研究免疫熒光結果顯示，CA1區自噬標記物LC3及Beclin-1蛋白表達水平均顯著高于CA3區，說明腦缺血再灌注引起腦損傷可能主要是因為激活了海馬CA1區的自噬。海馬亞區自噬相關蛋白表達的差異可能是造成其對腦缺血損傷具有不同敏感度的重要原因之一。

本研究證實腦缺血再灌注可提高海馬區LC3、Beclin-1蛋白表達水平，激活神經細胞內的自噬，并進一步引起細胞損傷。且模型動物海馬CA1區的自噬相關蛋白LC3、Beclin-1表達水平顯著高于CA3區，暗示CA1區對腦缺血損傷具有較高的敏感度。但腦缺血再灌注如何調控CA1與CA3區LC3、Beclin-1蛋白的表達差異尚有待于更進一步研究。

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Study on the autophagy of hippocampus after focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

ZHAOYaqian,HUANGGuowei,CHENShuang,etal.

(DepartmentofNutritionandFoodHygiene,SchoolofPublicHealth,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

ObjectiveTo investigate the damage of hippocampal neural cells,the changes of autophagy and the difference of autophagy between the CA1and CA3region of hippocampus after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.MethodsThe focal cerebral ischemia-reperfusion model was induced by an intraluminal filament embolism.The SD rats were randomly divided into 3 groups:the control group (Control group),the sham-operated group (Sham group) and the middle cerebral artery occlusion- reperfusion group (MCAO group).HE staining was employed to detect the damage of hippocampal neurons in rats.The formation of autophagosomes in hippocampal neurons was observed by using transmission electron microscope.The expression levels of autophagy related protein Beclin-1 and LC3 in hippocampus CA1and CA3region was detected by immunofluorescence assay.ResultsThe hippocampal neurons in ischemia brains were damaged seriously and the formation of autophagosomes were detected by transmission electron microscope.Compared with Control group and Sham group,the results by immunofluorescence showed that the expression of LC3 and Beclin-1 protein in hippocampus neurons were significantly increased,and the expression in CA1region was significantly higher than that in CA3region (P<0.05).ConclusionCerebral ischemia-reperfusion can activate autophagy in hippocampal neurons,and further cause cell damage.The level of autophagy of CA1region of the model animals was significantly higher than that of CA3region,suggesting that CA1region had a high sensitivity to cerebral ischemia injury.

Ischemia-reperfusion injury;Autophagy;Hippocampus;LC3;Beclin-1

1003-2754(2016)04-0320-03

2015-12-07；

2016-03-29

國家自然科學基金(No.81373003)；中國博士后科學基金(No.2014M550148)

(天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，天津 300070)

張緒梅，E-mail：zhangxumei@tmu.edu.cn

R743.3

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