慢性應激對大鼠行為學及腦神經顆粒素水平的影響及藥物防治

徐天勇，李仲銘，劉　銳,　張　祥,　范　艷,　胡月新

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慢性應激對大鼠行為學及腦神經顆粒素水平的影響及藥物防治

徐天勇1，李仲銘2，劉銳3,張祥2,范艷2,胡月新1

目的探討慢性應激對大鼠外顯行為學變化的影響，檢測體內兒茶酚胺類物質及神經顆粒素(Neurogranin，Ng)表達的變化及三七皂苷Rg1的防治效果。方法成年雄性SD大鼠36只，隨機分為對照組(CON)、模型組(CUS)、和治療組(CUS-G)，采用慢性不可預見性應激方法建立慢性應激動物模型；采用曠場試驗檢測行為學變化，運用Morris水迷宮實驗進行學習記憶力測試，使用放射免疫法檢測血漿、腦組織兒茶酚胺類含量，Western blot法檢測皮質、海馬、下丘腦Ng含量。結果6 w慢性應激后，實驗組大鼠在水平運動和垂直運動方面得分均明顯低于對照組與藥物組，均P<0.05；水迷宮實驗顯示慢性應激后動物逃避潛伏期明顯延長，而治療組大鼠逃避潛伏期呈下降趨勢(P<0.05)；血漿、腦組織去甲腎上腺素與多巴胺在對照組、實驗組與藥物組間無明顯變化；慢性應激大鼠皮質、海馬、下丘腦Ng含量水平皆與模型大鼠有差異(P<0.05、P<0.01、P<0.05)，治療大鼠皮質、海馬、下丘腦Ng含量亦皆與模型大鼠有差異(P<0.01、P<0.05、P<0.05)。結論慢性應激研究領域，神經顆粒素的敏感性優于單胺類神經遞質，可作為敏感指標加以觀察；100 mg/kg劑量的三七皂苷Rg1能夠抑制應激所致學習記憶功能紊亂，對應激所致外顯行為有積極的調節作用，對腦內神經顆粒素表達水平降低趨勢有較好抑制作用。

慢性不可預見性應激；學習記憶；兒茶酚胺類物質；神經顆粒素；三七皂苷Rg1

傳統應激理論認為過度應激使腦組織兒茶酚胺類神經遞質耗損，進而引起情緒、認知行為異常表現[1],近些年研究發現腦認知功能區域特異性蛋白-神經顆粒素亦在學習記憶、神經發育方面扮演重要角色[2,3]。本實驗擬探討慢性應激對大鼠學習記憶功能的影響及在此過程中兒茶酚胺類神經遞質、Ng表達的變化，觀察三七皂苷Rg1對應激模型大鼠腦組織兒茶酚胺類神經遞質、Ng表達的影響，為應激綜合征的臨床防治及新藥開發提供理論依據。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器Morris水迷宮(北京杰日歐公司提供)；三七皂苷Rg1：白色晶狀粉末物質，昆明制藥廠提供，純度>98.57%；兒茶酚胺放射免疫測定盒(天津協和醫藥科技有限公司代理，美國DIASOURCE公司)；GC-2016γ放射免疫計數儀(美國PICKER公司)；兔抗大鼠Ng抗體(Abcam公司)，山羊抗兔IgG辣根酶標記(北京中杉金橋生物技術有限公司)，β-actin 單克隆抗體(美國Sigma公司)；Ge1.Doc凝膠成像半定量分析系統購自Bio-Rad公司。

1.2實驗動物及分組

1.2.1實驗動物成年健康雄性SD大鼠36只(體重200±5 g，昆明醫科大學實驗動物中心提供，符合GB/T14925-94標準)。適應性飼養1 w后,按隨機數字表法分為以下3組：對照組(CON)、慢性不可預見性應激試驗組(CUS)、藥物治療組(CUS-G)，每組12只。

1.2.2造模及給藥方法采用以下應激源:行為限制(2 h)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、食物剝奪(12 h)、飲水剝奪(12 h)合并空瓶刺激、明暗顛倒(12 h)、濕籠(12 h)、傾斜(45 ℃,12 h)刺激動物。實驗持續6 w，每天隨機抽取兩種應激源作用于大鼠，使之無法預知何種刺激將要發生[1]。對照組飼養于同一環境，合籠飼養且無應激源刺激，每次復制模型前1 h給3組大鼠灌胃，對照組、慢性不可預見性應激組予以生理鹽水，藥物治療組予以三七皂苷Rg1100 mg/kg，藥物溶于純化水，灌胃容積均為0.6 ml/只[4,5]。

1.3行為學檢測

1.3.1曠場試驗裝置為36 cm×36 cm×36 cm無頂紙箱，箱底用墨線分成9個等分方格，將大鼠置于中央方格內，觀察30 s內活動情況。統計方法：動物1/2以上身體從所在方格進入相鄰方格計1分，大鼠后肢直立計1分[1]。

1.3.2Morris水迷宮實驗實驗前、模型期結束后分別對大鼠進行用Morris水迷宮測定大鼠空間學習記憶的能力。在水池上標定相同一點作為每次實驗入水點，站臺置于離入水點較遠的象限的中間，實驗采用預先訓練兩次，將動物從相同入水點放入，每次訓練2 min的方案，若動物在2 min 內找到平臺，并在其上停留3 s為合格者，記錄其找到平臺的時間作為逃避潛伏期，若動物2 min內未找到平臺，將動物放到平臺上使之停留3 s，其逃避潛伏期記為120 s，記錄第3次的數據作為評價標準[1]。

1.4標本制備模型期結束后用10%水合氯醛腹腔內注射麻醉后固定于手術臺，剪開胸腔，暴露心臟，用5 ml注射器針頭插入左心室，采血5 ml放入抗凝管中,3000 r/min離心10 min,取血清-20 ℃保存,待測。采血后立即灌注生理鹽水，待右心耳膨起，剪開右心耳讓血液流出，至右心耳流出液為無色透明，冰浴環境下剖顱分離皮質、海馬[5]。

1.5腦組織制備冰浴環境下剖顱分離的腦組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入2 ml PE管內；用移液管量取9倍于組織塊重量預冷的0.86%冷生理鹽水(用0.9%生理鹽水進行調配)于PE管中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊；超聲粉碎(振幅12.7 mm，30 s),將制備好的10%勻漿用低溫低速離心機3000 r/min左右，離心10 min，離心好的勻漿留上清棄沉淀[5]。

1.6血漿、腦組織兒茶酚胺類物質檢測按放免診斷藥盒說明操作,用GC-1200γ計數放免儀檢測血液、腦組織兒茶酚胺含量。

1.7蛋白免疫印跡檢測Ng表達冰浴環境下剖顱分離的皮質、海馬組織，液氮速凍后研磨成粉狀，分別取50 mg皮質、海馬組織，加入750 μl RIPA buffer，冰浴下勻漿，4 ℃，12000 rpm離心30 min，取上清進行BCA法蛋白濃度測定。取樣本加入上樣緩沖液后進行電泳，轉至PVDF膜，以封閉液封閉2 h后加入一抗(1∶800)，4 ℃搖晃孵育過夜，TPBS漂洗3次，每次15 min，加入羊抗兔IgG抗體(1∶3000)，室溫孵育2 h；TPBS漂洗3次/15 min。將PVDF膜上加入ECL發光液，待反應1 min后，放入膠片、顯影、定影，膠片經Bio-Rad膠片掃描系統掃描后，Ge1.Doc凝膠成像分析軟件分析，蛋白表達水平以Ng光密度值與對應內參β-actin光密度值比值表示，單位為光密度單位(Optical Density Unit，ODU)[6]。

2　結　果

2.1慢性不可預見性應激對大鼠曠場作業的影響實驗前各組大鼠在單位時間內在水平運動、垂直運動得分無差異，6 w慢性應激后實驗組大鼠在水平運動和垂直運動方面得分與對照組、藥物組呈現明顯差異，均P<0.05(見圖1、圖2)。

2.2學習記憶變化(水迷宮實驗)實驗前對大鼠進行水迷宮測試，結果表明各組動物逃避潛伏期無明顯差異；實驗開始3 w后對照組、藥物組動物水迷宮測試逃避潛伏期呈現不同程度縮短并持續到第6周，實驗組逃避潛伏期在第3周已顯現延長趨勢并持續到第6周，并在第3周、第6周分別與對照組、藥物組形成較大差異(見表1)。

2.3血漿兒茶酚胺含量的變化及藥物干預作用6 w慢性應激后，實驗組血漿多巴胺和去甲腎上腺素均有不同程度的升高，但與空白組、藥物組尚無明顯差異,均P>0.05(見表2)。

2.4腦組織兒茶酚胺含量的變化及藥物干預作用6 w慢性應激后，實驗組大鼠腦組織多巴胺有升高趨勢，去甲腎上腺素則呈下降趨勢，但不同趨勢與空白組、實驗組均無統計學意義,均P>0.05(見表3)。

2.5慢性應激對大鼠腦組織Ng蛋白質表達的影響通過Western-blotting分析發現，6 w應激后，大鼠皮質、海馬、下丘腦神經顆粒素蛋白帶的平均光密度值(IOD)均有不成程度改變：皮質實驗組神經顆粒素蛋白表達顯著降低，并與空白組、藥物組形成顯著性差異，均P<0.01；海馬實驗組神經顆粒素蛋白表達顯著降低，并與空白組、藥物組形成明顯、顯著性差異，P<0.05/P<0.01；下丘腦實驗組神經顆粒素蛋白表達亦降低，但與空白組尚未形成明顯差異，可能與時間點尚未到達有關，而實驗組與藥物組形成則明顯差異，P<0.05。上述結果表明慢性應激使得神經顆粒素蛋白在皮質、海馬和下丘腦中的表達均成降低趨勢，使用三七皂甙后能改變蛋白表達降低趨勢(見表4)。

表1　各組小鼠4 w 5次水迷宮測試成績比較　(單位

與CON組比較#P<0.01；與CUS組比較*P<0.05,**P<0.01

組別例數DANECONCUSCUS?G12121251．47±2．3458．36±5．753．64±3．4392．06±6．12101．11±10．599．93±3．79

組別例數DANECONCUSCUS?G1212127．31±1．488．49±1．677．52±1．821．06±0．120．97±0．101．05±0．12

表4　Western blot法檢測各組大鼠腦組織Ng蛋白表達影響　(單位

與CON組比較#P<0.05,##P<0.01；與CUS組比較*P<0.05,**P<0.05

與CON組比較#P<0.05；與CUS組比較*P<0.05

3　討　論

本次研究采用諸多不可預見性刺激因子模擬日常持續性低強度生活事件以最大程度模擬由各種長時程、低強度、適應不良等各類生活事件所引起的慢性應激狀態，與高強度刺激因素相比,此模型軀體應激因素較小，能更好地突出心理或情緒因素，是一種較好的負性心理應激動物模型[1，7]。

曠場試驗結果表明實驗前各組大鼠在新異環境中的探究行為和對新環境的警覺性并未有差異，因而其水平運動與垂直運動得分并未有異常表現，隨著應激時程延長，應激大鼠水平、垂直活動次數減少，在原格停留時間延長，上述改變表明應激大鼠的活動度降低，對新鮮環境的好奇程度降低，動物的絕望和行為退縮行為增強，行為表現由初始的興奮狀態過渡到抑制狀態。此外，應激開始前預防性給予三七皂苷Rg1直至應激結束，則能改善大鼠在曠場試驗中的表現，即水平運動與垂直運動得分比實驗組大鼠增加，差異有統計學意義(P<0.05)，表明三七皂苷Rg1能改善由慢性應激引起的體力下降、興趣缺乏及活動遲滯，減輕了動物自身的疲勞感，使機體保持一定的興奮性，不同程度地逆轉模型大鼠的“軀體疲勞”和“心理疲勞”，使其體力恢復、活動增加。

較多研究資料證實，應激因素作用于機體時，通過多種通路引起神經遞質、信號轉導以及突觸可塑性等方面的改變，從而影響機體學習記憶功能[8～10]。因此，對學習記憶力能力的評估亦為評價慢性應激程度的主要檢測方法。本研究運用Morris水迷宮實驗對大鼠空間覓向能力和空間學習記憶能力進行檢測，發現慢性應激后大鼠空間記憶能力明顯受損，即應激大鼠逃避潛伏期明顯延長，提示慢性束縛應激可導致實驗動物對已儲存記憶的讀出或提取過程產生負面影響。應激前預防性給予三七皂苷Rg1直至應激結束，應激期后水迷宮實驗結果顯示大鼠在Morris水迷宮測試中的成績有明顯改善，差異有統計學意義(P<0.05)，而認知行為是腦力作用的表現形式之一，表明三七皂苷Rg1能改善應激所致的學習記憶功能的損傷。

慢性應激與學習記憶間關系的研究，既往研究主要集中在腦組織單胺類神經遞質與學習記憶關系方面。腦組織茶酚胺類神經遞質在中樞神經系統中參與機體覺醒、注意力和學習記憶功能的調節。先前本課題組研究發現慢性應激導致動物腦組織兒茶酚胺類神經遞質減少，動物學習記憶能力降低的外顯行為學表現亦有明顯改變，上述變化與應激致腦組織對兒茶酚胺類(Catecholamines,CA)神經遞質的消耗增加，而外周CA又因肝酪氨酸氨基轉化酶活性增高而分解加速，影響CA合成前體物質的轉運有關[11～13]。

在本次研究中，動物歷經6 w慢性應激后，實驗動物腦組織多巴胺和去甲腎上腺素等CA類神經遞質的消耗與非應激動物相比并未有明顯變化，P>0.05，進而又對血漿CA進行檢測，實驗動物血漿多巴胺和去甲腎上腺素等CA類物質的含量與非應激動物相比并未有明顯變化，P>0.05，預防性給予三七皂苷Rg1并未使血漿、腦組織CA有明顯改變，P>0.05，上述實驗結果與之前研究結果有明顯差異(既往諸多研究結果提示慢性應激致使動物血漿/腦組織多巴胺和去甲腎上腺素等CA類物質含量發生變化)，提示學習記憶減退并非由單一因素決定，尚有其余神經相關物質參與應激反應調節[1]。

皮質、海馬、下丘腦作為學習記憶及認知活動的重要腦區，其內部必然有除DA、NE以外與學習記憶功能密切相關的功能性物質和結構存在；否則，學習記憶的電生理活動無法引起神經系統形態學變化和功能新變化[14～16]。研究發現在皮質、海馬、下丘腦的區域神經元胞體、樹突和樹突棘間內部存有由78個氨基酸組成的高密度神經元突觸后膜蛋白-神經顆粒素，深入研究表明神經顆粒素作為蛋白激酶C的天然作用底物和鈣調蛋白CaM的結合蛋白，參與神經元的突觸形成、分化，而后者在學習能力的高低及記憶持久性方面扮演重要角色[17～20]。

本次研究發現慢性應激致使皮質、海馬、下丘腦神經元細胞Ng蛋白含量下降，進而致使神經元細胞數量減少伴突棘數量減少，突觸可塑性的損害造成大鼠水迷宮實驗潛伏期延長，外顯為學習記憶能力的降低。使用三七皂苷Rg1后Ng蛋白含量明顯升高，甚至略高于對照組，提示三七皂苷Rg1具有對抗慢性應激所致Ng蛋白含量下降之積極作用，而Ng蛋白含量的升高促使皮質、海馬、下丘腦細胞和/或樹突棘結構的數量隨之上升，進而促進突觸可塑性及突觸傳遞效能增強，使得學習記憶功能得以提高。但三七皂苷Rg1如何上調Ng蛋白含量的機制尚需進一步研究。

總之，本研究發現慢性應激可致動物出現不同程度的行為學變化，而應激動物血液和腦組織中兒茶酚胺類神經遞質并未出現大幅度變化，甚至變化趨勢亦未有之，提示傳統兒茶酚胺類神經遞質理論并非影響學習記憶之唯一因素；而定位于皮質、海馬、下丘腦內部的神經元特異性蛋白質NG卻產生明顯變化，故而在學習記憶的研究領域，神經顆粒素的敏感性優于單胺類神經遞質，在今后的研究中可將其作為敏感指標加以觀察。此外，本研究尚發現100 mg/kg劑量的三七皂苷Rg1能夠抑制應激所致學習記憶功能紊亂，對應激所致外顯行為有積極的調節作用，對腦內神經顆粒素表達水平降低趨勢有較好的上調作用。

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Research of ginsensode Rg1 on the expression of neurogranin in chronic unpredictable stress model rats

XUTianyong,LIZhongming,LIURui,etal.

(ExperimentCenterforMedicalScienceResearch,KunmingMedicalCollege,Kunming650031,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Ginsensode Rg1 on the expression of Neurogranin (Ng) in cortex,hippocampus and hypothalamus of rats with chronic stress model.Methods36 adult male SD rats were randomly divided into control group (CON),model group (CUS),and treatment group (CUS-G).The chronic stress model was established by chronic unpredictable stress.The morris water maze was used to study the memory test.The expressions of DA and NE were detected by using radioimmunoassay.The content of Ng in cortex,hippocampus and hypothalamus was detected by Western blot.ResultsThe water maze test showed that animal learning and memory ability decreased significantly after chronic stress,while the treatment group rats escape latency was significantly reduced,P<0.05；compared with control group，the content of DA and NE did not decrease significantly in model group (P>0.05).After 6 weeks of stress,rat cerebral cortex,hippocampus,hypothalamus Ng levels with chronic stress were significantly decreased compared with the model rats (P<0.05,P<0.01,P<0.05 respectively),the content of Ng content in cerebral cortex,hippocampus,hypothalamus were significantly increased with the model rat (P<0.01,P<0.05,P<0.05 respectively).ConclusionsIn chronic stress field,Ng is more sensitive than the monoamine neurotransmitters,it can be used as sensitive indicators to be observed.Chronic stress could change the behaviors of mice observably and the contents of Ng,the supplement of Ginsensode Rg1(100 mg/kg)could come into being some interference effects.

Chronic stress;Learning/memory；Atecholamines：Neurogranin；Ginsensode Rg1

1003-2754(2016)04-0311-05

2015-12-15；

2016-01-29

2012年云南省教育廳科學研究基金(2012C005);2014年國家自然科學基金(81460192)

(1.昆明醫科大學科研實驗中心,云南 昆明 650031;2.昆明醫科大學基礎醫學院人體解剖學與組織胚胎學系,云南 昆明 650031;3.昆明醫科大學基礎醫學院實驗中心，云南 昆明 650031)

胡月新,E-mail:hyxjx@sina.cn

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