阿托伐他汀對大鼠頸動脈粥樣硬化易損斑塊及hs-CRP和MMP-9表達的影響

郭恩會，路青山，楊霄鵬，許春陽，王一凡，張豪杰，楊幸文

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阿托伐他汀對大鼠頸動脈粥樣硬化易損斑塊及hs-CRP和MMP-9表達的影響

郭恩會1，路青山1，楊霄鵬1，許春陽1，王一凡1，張豪杰2，楊幸文1

目的研究阿托伐他汀對大鼠頸內(nèi)動脈粥樣硬化易損斑塊面積、數(shù)目及對基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達和血清hs-CRP的影響。方法將48只健康雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、常規(guī)劑量組、強化劑量組，14 w后采血測量hs-CRP,光鏡下觀察頸內(nèi)動脈粥硬化易損斑塊病理學變化，計數(shù)易損斑塊數(shù)目及面積，采用免疫組織化學法檢測易損斑塊中MMP-9的表達。結(jié)果與模型組相比，常規(guī)劑量組和強化劑量組易損斑塊計數(shù)、面積大小、MMP-9表達均明顯降低(P<0.01)，強化劑量組又低于常規(guī)劑量組(P<0.05)，強化劑量組和常規(guī)劑量組血清hs-CRP測定結(jié)果均明顯低于模型組(P<0.01)，強化劑量組又低于常規(guī)劑量組(P<0.05)。結(jié)論阿托伐他汀能夠穩(wěn)定及減少頸內(nèi)動脈粥樣硬化易損斑塊的形成和進展，對血清hs-CRP及MMP-9的表達具有抑制作用，并且其抑制作用與劑量具有量效關(guān)系。

頸動脈粥樣硬化；阿托伐他汀；易損斑塊；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

心腦血管疾病在我國已成為發(fā)病率和病死率第一的疾病，動脈粥樣硬化(AS)是其最常見的病因[1]，頸內(nèi)動脈粥樣硬化是全身動脈硬化的重要局部表現(xiàn)，頸內(nèi)動脈粥樣硬化易損斑塊的突然破裂及血栓形成是腦梗死的重要發(fā)病機制之一[2]，對于通過穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)頸內(nèi)動脈粥樣硬化易損斑塊而降低腦缺血卒中風險是目前臨床研究的重點。

高敏C反應蛋白(hs-CRP)是血管炎癥的敏感標志物，是與動脈粥樣硬化發(fā)生、演變和進展有關(guān)的促炎因子[3]，作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族重要成員之一的MMP-9的高度表達可通過介導血管中膜平滑肌細胞的遷移、增值、凋亡及細胞外基質(zhì)降解而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，并通過降解纖維帽內(nèi)膠原纖維及結(jié)蹄組織致使纖維帽變薄而形成易損斑塊[4,5]，故MMP-9水平高度表達可作為頸內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的檢測指標。

阿托伐他汀可降低炎性反應、抗動脈粥樣硬化、穩(wěn)定斑塊改善缺血性腦血管疾病，本研究旨在通過建立大鼠頸內(nèi)動脈粥樣硬化及其易損斑塊模型，觀察不同劑量阿托伐他汀對頸內(nèi)動脈粥樣硬化易損斑塊的穩(wěn)定及逆轉(zhuǎn)是否具有明顯差異。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康雄性SD大鼠48只，體重200～250 g，(1～2月齡)，由鄭州大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(豫)2010-0002。隨機分為4組(A、對照組，12只；B、模型組，12只；C、常規(guī)劑量組，12只；D、強化劑量組，12只)，飼料由河南省實驗動物中心提供，實驗大鼠在鄭大二附院專用動物房喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF級實驗條件要求。

1.1.2藥物及主要試劑阿托伐他汀(立普妥)由輝瑞制藥有限公司提供，批準文號：H20130103。MMP-9免疫組織化學染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型建立與實驗分組模型組、常規(guī)劑量組、強化劑量3組大鼠均參照Wilgram等[6]的方法，建立AS模型，按813 g/kg基礎飼料，5 g/kg膽酸鈉，30 g/kg膽固醇，50 g/kg白糖，10 g/kg豬油，2 g/kg丙基硫氧嘧啶，配制成高脂飼料，飲水不限，A組大鼠飼養(yǎng)普通飼料；B、C、D 3組大鼠在喂食前腹腔注射VitD3(70萬U/kg)，分3 d給完，隔天一次，每隔1 m追加一次VitD3(30萬U/kg)。B、C、D 3組大鼠每天給予高脂飼料約15 g，同時分別給予C組大鼠阿托伐他汀5 mg/kg·d、D組大鼠10 mg/kg·d溶于1 ml生理鹽水中灌胃，A、B組給予同等容量的生理鹽水灌胃，飼養(yǎng)同時定期檢測大鼠體重及健康狀況，持續(xù)14 w。喂養(yǎng)12 w后處死各組大鼠各一只手術(shù)切取左側(cè)頸內(nèi)動脈2 cm，10%甲醛固定、石蠟包埋連續(xù)切片HE染色，光鏡下觀察到B、C、D 3組大鼠切片頸內(nèi)動脈硬化的病理特征已出現(xiàn)，說明造模成功。

1.2.2hs-CRP測定各組大鼠喂養(yǎng)至14 w末禁食12 h，于尾靜脈取血2 ml，6000 r/min離心5 min，取上層血清，由日本DLYMPUS公司生產(chǎn)的AD2700全自動生化測試儀檢測血清hs-CRP水平。

1.2.3病理形態(tài)學和免疫組織化學檢測麻醉取血后，手術(shù)取各組大鼠雙側(cè)頸內(nèi)動脈各2 cm，用10%甲醛常規(guī)固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，偶數(shù)張HE染色，光學顯微鏡觀察血管病理形態(tài)改變，用圖像分析儀測量各組斑塊總面積及斑塊面積/動脈總面積，并計量易損斑塊數(shù)。奇數(shù)張切片行MMP-9免疫組化染色，MMP-9免疫組化染色嚴格按其試劑盒說明書操作。

2　結(jié)　果

2.1血清hs-CRP水平檢測模型組血清hs-CRP水平均明顯高于常規(guī)劑量組和強化劑量組(P<0.01)，且常規(guī)劑量組顯著高于強化劑量組(P<0.01)(見表1)。

2.2頸內(nèi)動脈壁斑塊面積的改變手術(shù)取大鼠頸內(nèi)動脈，光學顯微鏡觀察血管病理形態(tài)改變，定量分析圖像分析儀測量頸內(nèi)動脈斑塊結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組斑塊總面積及斑塊總面積/動脈總面積與對照組比較明顯增加(P<0.01)；強化劑量組斑塊面積及斑塊總面積/動脈總面積比常規(guī)劑量組明顯減小(P<0.05)；常規(guī)劑量組斑塊面積及斑塊總面積/動脈總面積比對照組明顯減小(P<0.05)(見表2)。

2.3動脈粥樣硬化斑塊特征的觀察將各組大鼠頸內(nèi)動脈切片偶數(shù)張行HE染色后光鏡下觀察，對照組頸內(nèi)動脈管腔均勻，管壁光滑，模型組頸內(nèi)動脈管腔明顯變窄、內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)含大量的泡沫細胞及炎癥細胞，管壁質(zhì)地易碎并彈性明顯下降，常規(guī)劑量組粥樣硬化病變減輕，管腔狹窄、內(nèi)膜增厚較對照組減少，強化劑量組病變明顯減輕，可見鈣化斑形成，且動脈較對照組柔軟有彈性(見圖1)，將脂質(zhì)核心大于斑塊40%者判定為易損斑塊，D組易損斑塊計數(shù)明顯小于C組(P<0.05)(見表3)。

2.4MMP-9免疫組織化學改變免疫組織化學染色鑒定MMP-9表達變化(結(jié)果見圖1)，常規(guī)劑量組MMP-9免疫組織化學染色強度、陽性細胞率、總積分與模型組比較明顯降低(P<0.05)，強化劑量組MMP-9免疫組織化學染色強度、陽性細胞率、總積分與常規(guī)劑量組比較明顯降低(P<0.05)(見表4)。

表1　4組大鼠血清hs-CRP水平比較

與對照組比較*較*P<0.05；與模型組比較△P<0.05；與常規(guī)劑量組比較#P<0.05

表2　4組頸內(nèi)動脈總面積、斑塊面積及斑塊面積與動脈總面積的比較

與對照組比較*較*P<0.05；與模型組比較△P<0.05；與常規(guī)劑量組比較#P<0.05

表3　各組粥樣硬化易損斑塊數(shù)比較

與模型組組比較*P<0.01；與常規(guī)劑量組比較#P<0.05

表4　MMP-9免疫組織化學表達

與模型組組比較*P<0.01；與常規(guī)劑量組比較#P<0.05

圖1A:正常組；B:模型組；C:常規(guī)劑量組；D:強化劑量組

3　討　論

AS引起血管腔狹窄、血液循環(huán)減少導致腦供血不足及易損斑塊破裂、栓子脫落引起的腦栓塞是缺血性腦卒中的主要病因。有研究表明[7，8]，在AS形成及斑塊的不穩(wěn)定性改變中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)起到關(guān)鍵性作用，MMPS參與AS是的血管重構(gòu)、斑塊破裂、血栓形成等一系列病理生理過程，MMPS表達越高，其纖維成分大量降解，使斑塊破潰形成附壁血栓機率越高，斑塊越易脫落而導致腦栓塞等疾病的發(fā)生，其中MMP-9是MMPS中分子量最大的酶，有學者通過對因頸動脈粥樣硬化斑塊形成導致頸動脈重度狹窄的患者抽血檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿MMP-9水平在診斷為易損斑塊及具有臨床癥狀的患者中明顯升高[9]。國內(nèi)關(guān)良勁等[10]研究發(fā)現(xiàn)MMP-9與頸動脈內(nèi)膜中層厚度、總斑塊積分、易損斑塊積分呈正相關(guān)性，而和穩(wěn)定斑塊積分無相關(guān)性，說明血漿MMP-9水平的提高和頸動脈內(nèi)膜中層增厚及斑塊的不穩(wěn)定性有著密切的聯(lián)系。hs-CRP因其可引發(fā)炎癥反應參與到AS的形成及進展過程，還可促使AS易損斑塊的破裂及血栓形成，所以hs-CRP可作為AS易損斑塊形成及進展的一個危險指標。

阿托伐他汀是甲基戊二酰輔酶A(HMC-COA)還原酶抑制劑通過抑制內(nèi)源性膽固醇合成而降低血清膽固醇，在臨床上被廣泛應用于調(diào)脂，近年來，由于它的抗AS作用被發(fā)現(xiàn)后，越來越受到重視。日本ESTABLISH研究[11]及Wong B等[12]證實，阿托伐他汀具有逆轉(zhuǎn)AS作用，它可減少AS脂紋面積及巨噬泡沫細胞大小、炎癥細胞、CRP沉積，抑制泡沫細胞和平滑肌細胞產(chǎn)生的MMPS、穩(wěn)定AS易損斑塊。本研究中，B組的頸內(nèi)動脈管腔明顯變窄，內(nèi)膜增厚，內(nèi)含大量泡沫細胞及炎癥細胞，光鏡下可見易損斑塊內(nèi)新生血管增生，證明造模成功。C組和D組的血清hs-CRP及斑塊中MMP-9表達均明顯低于B組，這和國內(nèi)相似研究得出的結(jié)果相符。本研究中，采用不同劑量阿托伐他汀干預AS大鼠頸內(nèi)動脈易損斑塊的形成及進展，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AS大鼠頸內(nèi)動脈易損斑塊計數(shù)、總斑塊面積/總動脈面積、斑塊內(nèi)MMP-9表達等均存在明顯差異(P<0.05)，提示阿托伐他汀抗AS、穩(wěn)定及逆轉(zhuǎn)斑塊、降低腦缺血卒中的作用與其劑量呈正相關(guān)性，同時在本實驗中光鏡下發(fā)現(xiàn)易損斑塊內(nèi)新生毛細血管數(shù)明顯增多，提示新生毛細血管的形成可能參與了易損斑塊的形成及進展，但新生血管形成的機制尚不清楚，是否能通過減少斑塊內(nèi)新生血管的形成來抗AS，需要更加深入的研究。

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Effect of atorvastatin on atherosclerotic plaque of carotid artery and the expression of matrix metallopro-teinases-9(MMP-9) and hs-CRP in rats

GUOEnhui，LUQingshan，YANGXiaopeng，etal.

(DepartmentofNeurology，TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

ObjectiveTo study the inhibition effect of atorvastatin on the aortic unstable plaque area of routine atherosclerosis and the expression of MMP-9 and hs-CRP.MethodsForty eight healthy male SD rats were divided into normal group,model group,conventional-dose group and Strengthening dose group.After fourteen weeks,we measured the hs-CRP of blood,observed the pathological changes of atherosclerotic plaque under light microscope,counted the number and area of the vulnerable plaques,and observed the expression of MMP-9 through immunohistochemistry.ResultsCompared with the model group,the number and area of the vulnerable plaques,and the expression of MMP-9 of conventional-dose group and strengthening dose group were all markedly reduced(P<0.01)，the results in Strengthening dose group was less than the conventional-dose group(P<0.05),the analysis results of hs-CRP in the conventional-dose group and the strengthening dose group were less than the model group(P<0.01),the Strengthening dose group was less than the conventional-dose group(P<0.05).ConclusionThe atorvastatin can enhance plaque stability and reduce the formation and progress of the aortic plaque,restrain the expression of MMP-9 and hs-CRP,and its restrain effect has dose-effect relationship with its dose.

Atherosclerotic plaque of carotid artery;Atorvastatin;Unstable plaque;Matrix metallopro-teinase-9

1003-2754(2016)04-0307-04

2016-02-23；

2016-03-30

河南省醫(yī)學科技攻關(guān)計劃項目(No.201303087)

(1.鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000；2.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100000)

楊霄鵬，E-mail:yaxipe39@126.com

R743.1

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