槲皮素對宮頸癌細胞SiHa遷移和侵襲能力的影響

張 欣，董春力，陳嘉彥，高小翠，李少聞

(1.西安交通大學第二附屬醫院婦產科；2.手術麻醉科;3.兒科，陜西 西安 710004)

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，其發病率高居女性惡性腫瘤的第二位，是一種嚴重危害女性健康的惡性疾病[1]。在宮頸癌患者中，淋巴轉移是宮頸癌患者不良預后的一個重要表現[2]，而且，腫瘤的侵襲和轉移也是導致治療失敗以及引發宮頸癌患者死亡的一個重要原因[3]。槲皮素 (quercetin，Que)是一種廣泛分布于植物的果實、葉子以及花中的中草藥材，具有廣泛的藥理和生理作用，例如免疫調節、清除自由基、抗菌以及抗病毒等。越來越多的研究表明，槲皮素還具有抗腫瘤的生物學作用，槲皮素不僅可以抑制腫瘤細胞的增殖，還可以有效抑制多種腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。因此，本研究通過槲皮素處理人宮頸癌SiHa細胞,觀察槲皮素對SiHa細胞遷移和侵襲能力的影響，并初步探討其相關的作用機制，為槲皮素的臨床應用提供一定的實驗基礎。

1材料與方法

1.1材料

人宮頸癌SiHa細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。槲皮素購于Sigma公司，DMEM培養基購于Gibco公司，胎牛血清購于四季青公司，基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9， MMP9)鼠單克隆抗體和β-肌動蛋白(β-actin)鼠單克隆抗體均購于Santa Cruz公司，基質膠(Matrigel) 膠購于美國 Roche 公司；24 孔 Transwell 侵襲小室購于美國 Corning 公司，其余為國產分析純試劑。

1.2方法

1.2.1細胞培養

人宮頸癌SiHa細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于含5%CO2的37℃孵箱中進行常規培養，每3～4天用胰酶消化，傳代1次。

1.2.2槲皮素的配置與實驗分組

將槲皮素溶解于二甲基亞砜(DMSO)中配置成儲存母液，于-20°冰箱保存。在進行實驗時，用DMEM培養基分別進行稀釋，DMSO的最終濃度<0.1%。 對數生長期的人宮頸癌SiHa細胞分為對照組(DMEM培養基+DMSO，槲皮素濃度為0μmol/L)和實驗組(槲皮素濃度分別為20、40和80μmol/L)。

1.2.3 Transwell體外遷移實驗

SiHa細胞饑餓24h后制備成細胞懸液，離心后吸棄培養液，PBS清洗1遍后，將細胞用含有0.1% 胎牛血清的DMEM培養基進行重懸，調整細胞濃度為4×105。將200 μL的細胞懸液加入于Transwell上室，下室中加入600μL的含 10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培養基，之后置于含5%CO2的37℃孵箱中進行孵育。24h后,用棉簽擦去上室內殘留的細胞,甲醛固定10min后，用0.1%的結晶紫室溫孵育10min，PBS清洗3遍后，將Transwell小室底面朝上于顯微鏡下拍照觀察,隨機選取5～10 個視野進行計數，進行統計分析，重復上述實驗3次。

1.2.4 Transwell體外侵襲試驗

SiHa細胞饑餓24h后制備成細胞懸液，離心后吸棄培養液，PBS清洗1遍后，將細胞用含有0.1% 胎牛血清的DMEM培養基進行重懸，調整細胞濃度為4×105。于Transwell上室中平鋪1:3的Matrigel膠50μL，紫外燈照射消毒6h后，將200μL的細胞懸液加入于Transwell上室，下室中加入600μL的含 10% FBS 的DMEM培養基，之后置于含5%CO2的37℃孵箱中進行孵育。24h后,用棉簽擦去上室內殘留的細胞和Matrigel膠,甲醛固定10min后，用0.1%的結晶紫室溫孵育10min，PBS清洗3遍后，將Transwell小室底面朝上于顯微鏡下拍照觀察,隨機選取5～10 個視野進行計數,進行統計分析，重復上述實驗3次。

1.2.5 Western Blotting

將處于對數生長期的SiHa細胞通過胰酶消化后，接種于6孔細胞培養板中，待細胞貼壁后, 更換為含有不同濃度槲皮素的DMEM培養基(槲皮素濃度分別為0、20、40和80μmol/L)，繼續培養48h后收集各組細胞，分別加入細胞裂解液收集細胞蛋白，并測定各組細胞的蛋白濃度。將蛋白樣本與蛋白質分子量標準分別上樣于加樣孔，進行SDS-PAGE分離蛋白。電泳結束后，進行轉膜，轉膜結束后，將膜移至含5%的脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1h，用TBST洗膜10min×4次 。加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜10min×4次，加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h，TBST洗膜10min×4次,然后用化學發光檢測液進行發光反應，于暗室中曝光。

1.3統計學方法

采用SPSS 12.0進行數據的統計學分析,實驗數據結果均采用均數±標準差表示，多組樣本間的均數比較采用單因素方差分析，兩組樣本間的均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1槲皮素抑制SiHa細胞體外遷移能力

為了研究槲皮素是否對人宮頸癌細胞SiHa的遷移能力具有影響，本研究首先通過使用Transwell小室，檢測了不同濃度下槲皮素對SiHa細胞遷移能力的影響。結果顯示，對照組中，每個視野下的細胞數為202.00±11.66，當槲皮素濃度分別為20、40和80μmol/L時，每個視野下的細胞數分別為148.80±14.01、46.00±15.36和13.80±3.96，同對照組相比均具有統計學意義(0μmol/L vs 20μmol/L：t=6.527，P=0.031；0μmol/L vs 40μmol/L：t=18.09，P=0.009；0μmol/L vs 80μmol/L：t=34.17，P=0.007，見圖1。上述結果表明，槲皮素可以抑制SiHa細胞體外的遷移能力，而且隨著槲皮素濃度的升高，這種抑制作用會進一步加強。

注：A為不同濃度槲皮素對SiHa細胞遷移的影響(結晶紫染色，40×)；B為槲皮素對SiHa細胞遷移的量化統計；*P<0.05，**P<0.01。

圖1 Transwell小室檢測槲皮素對SiHa細胞遷移能力的影響
Fig.1 The effect of quercetin on migration ability of SiHa cells detected by Transwell chamber

2.2槲皮素抑制SiHa細胞體外侵襲能力

此外，通過使用Transwell小室，進一步檢測了不同濃度下槲皮素對SiHa細胞侵襲能力的影響。結果顯示，對照組中，每個視野下的細胞數為138.00±13.40，當槲皮素濃度分別為20、40和80μmol/L時，每個視野下的細胞數分別為99.80±14.72、33.20±8.13和9.80±2.77，同對照組相比均具有統計學差異(0μmol/L vs 20μmol/L：t=4.291，P=0.029；0μmol/L vs 40μmol/L：t=14.95，P=0.0081；0μmol/L vs 80μmol/L：t=20.95，P=0.0074，見圖2。上述結果表明，槲皮素可以抑制SiHa細胞體外的侵襲能力，而且隨著槲皮素濃度的升高，這種抑制作用會進一步加強。

注：A為不同濃度槲皮素對SiHa細胞侵襲能力的影響(結晶紫染色，40×)；B為槲皮素對SiHa細胞侵襲的量化統計;*P<0.05，**P<0.01。

圖2 Transwell小室檢測槲皮素對SiHa細胞侵襲能力的影響
Fig.2 The effect of quercetin on invasion ability of SiHa cells detected by Transwell chamber

2.3 Western Blotting檢測槲皮素對MMP9表達的影響

為了進一步探討槲皮素影響SiHa細胞遷移和侵襲能力的作用機制，本研究通過Western Blotting方法檢測了SiHa細胞中MMP9蛋白的表達。結果顯示，同對照組相比，SiHa細胞在經過槲皮素處理后，MMP9蛋白的表達出現了明顯的下調(0μmol/L vs 20 μmol/L：t=9.318，P=0.0029；0μmol/L vs 40μmol/L：t=10.21，P=0.002；0μmol/L vs 80μmol/L：t=14.81，P=0.0007，見圖3。上述結果表明，槲皮素對SiHa細胞遷移和侵襲能力的抑制作用可能是通過下調MMP9蛋白的表達而實現的。

圖3 Western Blotting檢測槲皮素對SiHa細胞中MMP9蛋白表達的影響
Fig.3 The effect on MMP9 protein level in quercetin-treated SiHa cells detected by Western Blotting

3討論

槲皮素是一種天然的黃酮類物質，廣泛存在于植物的果實、花以及葉中，目前的研究表明，槲皮素不僅可以有效抑制前列腺癌、乳腺癌等腫瘤細胞的增殖，還可以抑制多種腫瘤的遷移能力和侵襲能力，例如在具有高轉移特性的肝癌HCCLM6細胞中，槲皮素可以抑制其增殖和侵襲的能力[4]；在膠質瘤細胞U87中，槲皮素可以明顯降低膠質瘤細胞的侵襲和遷移[5]；在結腸癌中，槲皮素不僅可以抑制結腸癌細胞的侵襲、運動和黏附，還可以抑制結腸癌細胞的增殖能力[6-7]；此外，槲皮素也可以抑制胃癌細胞BGC-803、口腔鱗狀細胞癌SCC-15、卵巢癌HO8910PM等腫瘤細胞的遷移和侵襲[8]。

3.1槲皮素可以顯著抑制SiHa細胞的遷移能力

Transwell小室遷移實驗的結果顯示，在對照組中，單個視野下的細胞數為202.00±11.66，而當槲皮素濃度為20μmol/L時，單個視野下的細胞數下降為148.80±14.01，當槲皮素濃度增加至40μmol/L時，單個視野下的細胞數下降為46.00±15.36，當槲皮素濃度增加至80μmol/L時，單個視野下的細胞數則下降為13.80±3.962，同對照組相比均具有統計學差異(均P<0.05)，上述結果表明，隨著槲皮素作用濃度的增加，SiHa細胞的遷移能力出現了明顯的下降，槲皮素可以顯著抑制SiHa細胞的遷移能力。

3.2 槲皮素可以顯著抑制SiHa細胞的侵襲能力

此外，通過Transwell小室侵襲實驗進一步檢測了槲皮素對SiHa細胞的侵襲能力的影響。在對照組中，單個視野下的細胞數為138.00±13.40，而當槲皮素濃度為20μmol/L時，單個視野下的細胞數為99.80±14.72，當槲皮素濃度增加至40μmol/L時，單個視野下的細胞數下降為33.20±8.13，當槲皮素濃度增加至80μmol/L時，單個視野下的細胞數則下降為9.80±2.77，同對照組相比均具有統計學差異(均P<0.05)，上述結果表明，槲皮素也可以抑制SiHa細胞的侵襲能力。

3.3 槲皮素通過下調MMP9蛋白的表達抑制SiHa細胞的遷移和侵襲能力

細胞基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組鋅離子依賴性肽鏈內切酶, 主要由腫瘤周邊的間質細胞以及腫瘤細胞所產生，不僅可以降解細胞外基質的大部分成分，還可以通過對細胞外基質的重塑從而促進腫瘤新生血管的生成, 最終促進腫瘤的侵襲和轉移。李世正等于2013年的研究也表明，在乳腺癌MDA-MB-435S細胞中，槲皮素也可以通過下調MMP9蛋白的表達而抑制細胞的侵襲能力[9]。此外，在胃癌BGC-823細胞中，槲皮素通過下調MMP2蛋白的表達可以抑制胃癌BGC-823細胞的侵襲能力[10]。同樣的，槲皮素通過下調MMP2和MMP9蛋白的表達，也可以抑制人結腸癌細胞的遷移和侵襲能力[6]。在本研究中，SiHa細胞在經過槲皮素處理后，隨著槲皮素濃度的提高，可以顯著抑制MMP9蛋白的表達。

綜上所述，槲皮素可以抑制SiHa細胞的遷移和侵襲能力，而槲皮素對于SiHa細胞遷移和侵襲能力的抑制作用可能是通過下調MMP9蛋白在SiHa細胞中的表達而實現的。

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[專業責任編輯：張忠明]