波紋巴非蛤酶解產物脫色脫腥及其分子量分布研究

陳海燕，鄭惠娜，曹文紅，周春霞，章超樺，郝記明，張 靜

（廣東海洋大學食品科技學院/廣東省水產品加工與安全重點實驗室/廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室/

國家貝類加工技術研發分中心（湛江），廣東 湛江　524088）

波紋巴非蛤酶解產物脫色脫腥及其分子量分布研究

陳海燕，鄭惠娜，曹文紅，周春霞，章超樺，郝記明，張 靜

（廣東海洋大學食品科技學院/廣東省水產品加工與安全重點實驗室/廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室/

國家貝類加工技術研發分中心（湛江），廣東 湛江524088）

為充分利用波紋巴非蛤蛋白資源，采用復合酶水解制備酶解液，以感官值和蛋白回收率為指標，選取粉末活性炭（氧化鋅炭、磷酸炭）、顆粒活性炭、硅藻土（10#、300#）、樹脂（LX-32、LSA-821），采用單因素試驗對波紋巴非蛤酶解液進行脫色脫腥，綜合確定最佳吸附條件并篩選出最佳吸附劑。以酶解液、樹脂體積質量比及流速為單因素優化最佳吸附劑柱層析分離條件，并采用凝膠層析分析脫色脫腥后酶解液的分子量分布。結果表明: 樹脂LX-32的動態吸附脫色脫腥效果最佳，最佳脫色脫腥工藝為酶解液與樹脂（V∶W）比2.5∶1、流速5 BV/h，在此條件下，酶解液感官值為7.8，蛋白回收率為78.70（± 0.47）%，分子量分布范圍147～4 729 u的組分所占比例為75.21%，具有較好的品質，可作為保健與營養食品基料。

波紋巴非蛤；酶解產物；脫色脫腥；分子量分布

陳海燕，鄭惠娜，曹文紅，等. 波紋巴非蛤酶解產物脫色脫腥及其分子量分布研究［J］.廣東農業科學，2016，43（8）：132-139.

波紋巴非蛤（Paphia undulta）是我國南方海域常見的一種海產貝類，俗稱花甲螺，在我國主要分布于福建、廣東、廣西等地沿海。波紋巴非蛤蛋白質含量高，氨基酸種類齊全，是優質的蛋白源。研究發現，波紋巴非蛤酶解產生的多肽具有降血壓、抗疲勞、抑菌、抗氧化等生物活性［1-4］，可用來開發保健與營養食品，增加其附加值。但在制備酶解液時，由于酶解過程較難控制，酶解產物通常腥味重［5］，顏色深，大大限制其生產應用。

通過吸附劑的吸附作用，能夠對蛋白酶解液起到一定的脫色脫腥效果。常見的吸附劑有活性炭、硅藻土和大孔樹脂等，其中活性炭在食品工業中應用廣泛［6-7］，在魚蛋白酶解液脫色中已取得了一定效果［8］；硅藻土在魚肉酶解液脫腥中有一定成效［9］；大孔樹脂作為通過范德華力和氫鍵作用進行物理吸附的一類高分子材料［10］，已廣泛用于多糖脫色［11-13］。將幾種不同性質的吸附劑進行篩選并優化脫色脫腥條件的研究目前少見報道。陳得科等［14］通過對比活性炭吸附法及微生物發酵法對波紋巴非蛤酶解液的脫腥效果進行研究，最終選擇了微生物法；任增超等［15］利用鹽析、掩蔽、活性炭吸附、β-環糊精包埋法對波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥，結果表明活性炭吸附法效果最佳，最佳條件下脫腥值為2。本研究選擇粉末活性炭、顆粒活性炭、硅藻土和樹脂對波紋巴非蛤酶解液進行靜態吸附及動態吸附試驗，綜合指標篩選出最佳吸附劑及脫色脫腥方法，確定最佳工藝條件，并分析最佳條件下脫色脫腥后酶解液的分子量分布，以期為波紋巴非蛤蛋白的精深加工提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

波紋巴非蛤，購于湛江市霞山東風市場，開殼后取肉洗凈瀝干，200 g分裝，于-20℃保存備用。風味蛋白酶（18×104U/g）、動物水解蛋白酶（23×104U/g），食品級，購于廣西龐博生物科技有限公司；粉末活性炭（氧化鋅炭、磷酸炭），食品級，購于上海興長活性炭有限公司；顆粒活性炭，食品級，購于北京太平洋活性炭制品有限公司；硅藻土10#、300#，食品級，購于廣州益康新材料科技有限公司；樹脂LX-32、LSA-821，食品級，西安藍曉科技新材料股份有限公司；分子量標準品：溶菌酶（Mr14300 u）、維色素B12（Mr1355.37 u）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Mr429.47 u）、L-酪氨酸（Mr181.19 u），購于Sigma公司。其余化學試劑均為分析純。

主要儀器設備：JA2003電子天平，上海恒平科學儀器有限公司；HZ-9212S恒溫振蕩器，太倉市科教器材廠；料理機，九陽股份有限公司；T25 高剪切乳化分散機，德國IKA；玻璃層析柱（φ2.6 cm×20 cm），上海滬西分析儀器廠有限公司；HL-2恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；Sigma 3k15高速冷凍離心機，貝朗國際生物工程公司；AKTA Purifier 100，GE Healthcare Bio-science AB公司。

1.2試驗方法

1.2.1波紋巴非蛤蛋白酶解液的制備 根據前期研究結果，將波紋巴非蛤肉解凍，絞碎，按料液比1∶3.4（W∶V）加入蒸餾水，5 000 r/min均質2 min，加入1 700 U/g動物水解蛋白酶和風味蛋白酶（1∶1）于50℃下攪拌酶解3.5 h，沸水浴中滅酶10 min，冷卻，于4 500 r/min 離心15 min，取上清液待用。

1.2.2樹脂預處理 食品級樹脂，濕基保存，使用時用蒸餾水洗至無細碎樹脂及雜質，抽濾脫水。

1.2.3不同吸附劑的脫色脫腥試驗 根據前期預試驗選擇氧化鋅炭、顆粒活性炭、10#硅藻土、LX-32樹脂優化粉末活性炭、顆粒活性炭、硅藻土和樹脂的最優條件。（1）溫度優化：在粉末活性炭、顆粒活性炭、硅藻土、樹脂的加入量分別為0.3%、5%、5%、4%，吸附時間分別為20、20、30、30 min時，以20、30、40、50、60℃的溫度對波紋巴非蛤酶解液進行脫色脫腥，3 500 r/min離心10 min，取上清液，測定蛋白回收率并進行感官評價。（2）時間優化：在上述篩選的溫度條件下，粉末活性炭、顆粒活性炭、硅藻土、樹脂的加入量分別為0.3%、5%、5%、4%時吸附10、20、30、40、50 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液，測定蛋白回收率及進行感官評價。（3）加入量優化：在上述篩選的溫度條件下，調整粉末活性炭的加入量為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%，顆粒活性炭、硅藻土的加入量為2%、3%、4%、5%、6%、7%，樹脂的加入量為2%、3%、4%、5%、6%，分別吸附上述篩選的時間后3 500 r/min離心10 min，取上清液，測定蛋白回收率及進行感官評價。（4）取一定量的酶解液，按上述優化的最優條件進行脫色脫腥，測定最優條件下的蛋白回收率并進行感官評價。

1.2.4樹脂動態吸附試驗 取一定量的LX-32樹脂裝填入層析柱中，取一定體積的波紋巴非蛤酶解液，用恒流泵分別以5、6 BV/h的流速泵入柱內進行脫色脫腥，收集洗脫液，測定蛋白回收率及進行感官評價。（1）酶解液與樹脂比例的優化：選擇酶解液與樹脂比（V∶W）為0.8∶1、1∶1、2∶1、2.2∶1、2.5∶1，以5 BV/h流速泵入柱內進行脫色脫腥，收集洗脫液，測定蛋白回收率及進行感官評價。選擇2∶1、2.2∶1、2.5∶1以6 BV/h流速泵入柱內進行脫色脫腥，收集洗脫液，測定蛋白回收率及進行感官評價。（2）2.5∶1（5 BV/h）與2∶1（6 BV/h）兩種條件下的脫色脫腥效果比較：選擇酶解液與樹脂比為2.5∶1 以5 BV/h的流速泵入柱內與2.0∶1以6 BV/h流速泵入柱內對波紋巴非蛤酶解液進行脫色脫腥，收集洗脫液，測定蛋白回收率及進行感官評價。

1.2.5酶解產物經樹脂動態吸附后分子量分布的測定 酶解產物經樹脂動態吸附后分子量分布采用AKTA Purifer 100進行分析，色譜柱為 SuperdexTMPeptide 10/300 GL，流動相為0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4，含0.15 mol/L NaCl）。將4種標準品抑肽酶（Mr6511.44 u）、維生素B12（Mr1355.37 u）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Mr429.47 u）、L-酪氨酸（Mr181.19 u）配制成溶液，上樣量20 μL，流速0.7 mL/ min，檢測214 nm處的吸光值，建立分子量大小的對數對保留時間t的回歸曲線。將樣品過0.22 μm微濾膜，在相同的條件下進行洗脫。其標準品回歸方程為lgMw=-0.1121t+5.6769 ，決定系數R2=0.9937，說明方程能很好反映這兩者之間的關系。

1.2.6蛋白回收率的測定方法 采用凱氏定氮法［16］。

1.2.7感官鑒定 固定10個人的評定小組，對吸附后酶解液進行顏色、氣味的綜合評價，并按1～9的等級分類評比，感官鑒定值為評定小組的平均得分（表1）［17］。

表1　評分標準

1.3數據分析

采用Excel2003進行數據處理，SPSS 17.0進行方差（ANOVA）分析，數據兩兩之間進行T檢驗，采用Origin8.5作圖。

2　結果與分析

2.1不同吸附劑條件的優化

2.1.1溫度對吸附劑脫色脫腥效果的影響 由圖1～圖4可知，波紋巴非蛤酶解液經粉末活性炭、顆粒活性炭、硅藻土、樹脂處理后，其感官值的整體趨勢隨著溫度的升高而增大，達到峰值后，隨溫度的升高而減小，其中40℃時效果最好。經粉末活性炭處理后，蛋白回收率變化不明顯；經顆粒活性炭處理后，在50℃之后大幅度減小；經硅藻土處理后，先隨溫度的升高達到最大值，之后開始降低，其中40℃時蛋白回收率最大；經樹脂處理后，在40℃之后略有降低。綜合考慮，4種吸附劑的最適脫色脫腥溫度都為40℃。經方差分析，4種吸附劑處理后不同溫度間感官值差異顯著，蛋白回收率經粉末活性炭處理差異不顯著，經顆粒活性炭、硅藻土、樹脂處理差異顯著。

圖1　溫度對粉末活性炭脫色脫腥效果的影響

圖2　溫度對顆粒活性炭脫色脫腥效果的影響

圖3　溫度對硅藻土脫色脫腥效果的影響

圖4　溫度對樹脂脫色脫腥效果的影響

圖5　吸附時間對粉末活性炭脫色脫腥效果的影響

2.1.2吸附時間對吸附劑脫色脫腥效果的影響 由圖5～圖8可知，波紋巴非蛤酶解液經粉末活性炭、硅藻土、樹脂處理后，其感官值的整體變化趨勢隨吸附時間的延長而增大，達到最大值后開始有所減小。其中在30 min時效果最佳。圖6酶解液的感官值隨顆粒活性炭吸附時間的延長而增大。經粉末活性炭、樹脂處理后，蛋白回收率整體變化趨勢隨吸附時間的延長而降低，當吸附時間超過30 min時變化不大；經顆粒活性炭處理20 min后，下降幅度偏大；經硅藻土處理后，在30 min時達最大值。綜合分析上述結果，粉末活性炭、硅藻土和樹脂吸附時間以30 min為宜，顆粒活性炭以20 min為最合適。經方差分析，4種吸附劑處理后不同吸附時間之間感官值差異顯著，蛋白回收率差異也顯著。

圖6　吸附時間對顆粒活性炭脫色脫腥效果的影響

圖7　吸附時間對硅藻土脫色脫腥效果的影響

圖8　吸附時間對樹脂脫色脫腥效果的影響

圖9　添加量對粉末活性炭脫色脫腥效果的影響

圖10　添加量對顆粒活性炭脫色脫腥效果的影響

圖11　添加量對硅藻土脫色脫腥效果的影響

圖12　添加量對樹脂脫色脫腥效果的影響

2.1.3吸附劑用量對脫色脫腥效果的影響 由圖9～圖12可知，波紋巴非蛤酶解液感官值的整體變化趨勢隨著吸附劑用量的增加而增大，達到最大值后略有下降。其中粉末活性炭用量為0.5%時效果最好；顆粒活性炭和硅藻土用量都為5%時，效果最佳；樹脂用量為4%時，效果最明顯。蛋白回收率的整體變化趨勢隨著吸附劑用量的增加而降低，其中在粉末活性炭、硅藻土、樹脂用量分別為0.5%、5%、4%之后，蛋白回收率趨于穩定，而顆粒活性炭在用量超過5%后蛋白回收率下降幅度偏大。綜合考慮，粉末活性炭、顆粒活性炭、硅藻土、樹脂的最適添加量分別為0.5%、5%、5%、4%。經方差分析，4種吸附劑處理后不同用量間感官值和蛋白回收率差異均顯著。

2.2最優條件下吸附劑對波紋巴非蛤酶解液脫色脫腥效果比較

由圖13可知，波紋巴非蛤酶解液經粉末活性炭（氧化鋅炭、磷酸炭），顆粒活性炭，硅藻土（10#、300#），樹脂（LX-32、LSA-821）處理后，感官值是顆粒活性炭最低，硅藻土300#次之，LX-32樹脂最高，蛋白回收率是顆粒活性炭最高，LX-32樹脂次之，磷酸炭最低。綜合考慮，選取LX-32樹脂進行動態吸附試驗。經方差分析，不同吸附劑間感官值和蛋白回收率都有顯著差異。

圖13　不同吸附劑對感官值、蛋白回收率的影響

2.3LX-32動態吸附脫色脫腥試驗

2.3.15BV/h流速下酶解液與樹脂比對波紋巴非蛤脫色脫腥效果的影響 由圖14可知，隨著酶解液與樹脂比的增大，感官值逐漸減小，蛋白回收率相應的逐漸增加，其中酶解液與樹脂比為2∶1～2.5∶1時蛋白回收率分別為73.44（±0.88）%、76.36（±0.58）%、79.51（± 0.35）%顯著高于0.8∶1及1∶1，綜合分析以上結果，選擇2∶1～2.5∶1來比較6 BV/h流速下脫色脫腥效果。經方差分析，不同比例間感官值和蛋白回收率都有顯著差異。

圖14　5 BV/h流速下酶解液與樹脂比對感官值、蛋白回收率的影響

2.3.26 BV/h流速下酶解液與樹脂比對波紋巴非蛤脫色脫腥效果的影響 由圖15可知，隨著酶解液與樹脂比的增大，感官值逐漸減小而蛋白回收率逐漸增加，其中2∶1時感官效果最好，2.5∶1時蛋白回收率最大，綜合考慮，選擇2∶1（ 6 BV/h）與2.5∶1（5 BV/h）比較脫色脫腥效果。經方差分析，酶解液與樹酯不同比例間感官值和蛋白回收率都有顯著差異。

圖15　6 BV/h流速下酶解液與樹脂比對感官值、蛋白回收率的影響

2.3.3酶解液與樹脂比為2∶1（6 BV/h ）與2.5∶1（5 BV/h）的比較分析 由圖16可知，波紋巴非蛤酶解液動態吸附條件為2.5∶1（5 BV/h）時效果較好，綜合考慮，選擇2.5∶1（5 BV/h）作為動態吸附的最佳條件。經T檢驗，兩種條件間感官值和蛋白回收率差異都不顯著。

2.4酶解產物最佳條件下脫色脫腥后的分子量分布

由圖17可知，最佳條件下脫色脫腥后的酶解液經凝膠色譜共分離出6個明顯的吸收峰，根據分子量分布，峰1、峰2和峰3的分子量在5 000 u以上，該組分主要是蛋白質，峰5和峰6主要是小肽和氨基酸，其中分子量分布范圍147～4 729 u組分所占比例為75.21%（表2）。

圖16　不同流速和酶解液與樹脂比對感官值、蛋白回收率的影響

圖17　酶解產物脫色脫腥后分子量分布

表2　酶解產物脫色脫腥后分子量分布

3　結論與討論

水產品酶解產物的脫色脫腥在水產品的高值化推廣利用方面起著重要作用。本研究比較的粉末活性炭（氧化鋅炭、磷酸炭）、顆粒活性炭、硅藻土（10#、300#）和樹脂（LX-32、LSA-821））對波紋巴非蛤酶解液脫色脫腥后的感官值和蛋白回收率。采用吸附劑處理，波紋巴非蛤酶解液的感官值隨著吸附溫度的升高、時間的延長、吸附劑用量的增加而增大，達到最大值后開始減小。這與文獻［9，18-23］報道的試驗結果相似。而蛋白回收率則隨著吸附劑用量的增加而降低，可能是高濃度的吸附劑在吸附色素和腥味物質的同時，也吸附了酶解液中部分具有極性的多肽類物質，使得酶解液蛋白含量降低［24］。經樹脂動態吸附，5 BV/h流速下效果更好，吸附理論表示流速慢，有利于色素分子和腥味物質與樹脂充分進行粒擴散和膜擴散，使色素和腥味物質被充分接觸吸附［25］。本試驗結果表明，LX-32樹脂效果較好，為此選取LX-32樹脂進行動態吸附試驗。經過條件優化選出酶解液與樹脂比（V∶W）2.5∶1、流速5 BV/h為最佳脫色脫腥工藝條件。在該條件下，蛋白回收率為78.70（±0.47）%，感官值為7.8，具有較好的品質，對于保健與營養產品的開發具有深遠意義。這一方法對波紋巴非蛤酶解液脫色脫腥提供了理論基礎，針對水產品脫色脫腥的工業化應用是可行的。

波紋巴非蛤酶解液經樹脂動態吸附脫色脫腥后，酶解液分子量分布中低分子量組分占比較大。有研究表明低分子量的肽在抗炎、抗癌、抗氧化［26-27］等方面有顯著活性。此次試驗還未研究經樹脂動態吸附脫色脫腥后酶解液的功能特性，也未見相關報道，樹脂動態吸附脫色脫腥兼有分離純化［28］的作用，因此可為特定功能產品的開發提供一定的思路，有待進一步研究。此外，有關脫色脫腥前后褐變物質的形成，揮發性腥味物質的產生及是否完全脫除，原料經酶解顏色加深、腥味加重的機理也有待進一步研究。

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（責任編輯 崔建勛）

Study on decolorization，deodorization and molecular weight distribution of enzymatic hydrolysis prepared from Paphia undulta

CHEN Hai-yan，ZHENG Hui-na，CAO Weng-hong，ZHOU Chun-xia，ZHANG Chao-hua，HAO Ji-ming，ZHANG Jing
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University/ Guangdong Province Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety/ Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution/ National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing （Zhanjiang），Zhanjiang 524088，China）

In order to make full use of the clam protein resources，the enzymatic hydrolysate was prepared by complex enzymes hydrolysis in the paper. Taking the sensory evaluation and protein recovery rate as index，the powder activated carbon （Zinc oxide carbon，phosphate carbon），granular activated carbon，diatomite （10#，300#），resin （LX-32，LSA-821） were selected with single factor test for the decolorization and deodorization of enzymatic hydrolysate，the optimal adsorption conditions were determined and the best adsorbent was selected by comprehensive index. With the volume and mass ratio of enzyme solution to resin，flow rate as a single factor tooptimize the column chromatography separation condition of the best adsorbent，And the gel chromatography was used foranalyzing molecular weight distribution of enzymatic hydrolysate after decolorization and deodorization. The results showed that the best dynamic adsorption fordecolorization and deodorization was obtained by LX-32 resin. The optimized conditions were as follows: the ratio of enzymatic hydrolysate to resin was 2.5:1，the flow rate was 5 BV/h，under these conditions，the sensory value was 7.8，the protein recovery rate was 78.70（±0.47）%，the components of molecular weight ranged from 147 to 4 729 u accounted for 75.21%，which had good quality，and could be used as the base material of health and nutrition food.

Paphia undulta；enzymatic hydrolysis；decolorization and deodorization；molecular weight distribution

TS254.4

A

1004-874X（2016）09-0132-08

2016-06-12

國家現代農業產業技術體系（CARS-48-07B）；廣東省高校重大科研項目培育計劃項目（GDOU 2013050245）；廣東省水產品加工與安全重點實驗室開放基金（GDPKLAPPS140）

陳海燕（1989-），女，在讀碩士生，E-mail：chenhhy0209@163.com

章超樺（1956-），男，博士，教授，E-mail：zhangch2@139.com