一種芽胞桿菌生物被膜形成缺陷培養基的研究

李一平，沈漢國，喻國輝，王　燕，李　馳，葉志文，周東輝，吳緒波

（珠海市現代農業發展中心，廣東 珠海　519070）

一種芽胞桿菌生物被膜形成缺陷培養基的研究

李一平，沈漢國，喻國輝，王燕，李馳，葉志文，周東輝，吳緒波

（珠海市現代農業發展中心，廣東 珠海519070）

為尋找一種不支持芽胞桿菌正常形成生物被膜的培養基，比較枯草芽胞桿菌R31和168菌株在MSgg、NB、LB、BGM固體和液體培養基中形成的生物被膜形態差異，確定R31和168菌株生物被膜形成能力差異；根據R31在MSgg、NB、BGM培養基中振蕩培養的生長方式設計出BGM1和BGDM培養基，測定R31在BGM1和BGDM培養基上的生長曲線并比較R31菌株和168菌株在BGM1和BGDM上生物被膜形成的差異，然后測定枯草芽胞桿菌TR21菌株、解淀粉芽胞桿菌R21g9菌株、短芽胞桿菌L1菌株、膠質芽胞桿菌L2菌株在BGM1和BGDM培養基上生物被膜形成情況。結果顯示，R31在MSgg、NB、LB、BGM液體培養基表面形成薄皮，在MSgg、LB固體培養基和NA上形成具有褶皺的菌落，在BGM上形成光滑的菌落，R31在這些培養基中形成的生物被膜比168菌株厚實。R31在MSgg和BGM中早期（2 h）以游離狀態生長，對數生長期（4 h）菌體黏連出現鏈狀，對數生長中后期（8 h）菌體呈現網狀結構，但在NB培養基中主要以游離狀態生長，顯示營養而非培養條件影響R31的生長方式。于是將BGM培養基中的酵母提取物換為牛肉膏獲得BGM1培養基，將BGM1培養基的胰蛋白胨改為細菌學蛋白胨得到BGDM培養基，并發現R31和168菌株可以在BGM1上形成薄皮和菌落，不能在BGDM培養基上形成完整的薄皮和具有褶皺的菌落。待測菌株均能夠在BGM1培養基上形成厚薄程度有差異的薄皮和有褶皺的菌落，均不能在BGDM培養基上形成薄皮和具有褶皺的菌落。在BGDM中添加甘油或Mn可以恢復R31形成薄皮和擴散的褶皺菌落。芽胞桿菌在BGDM培養基上不能正常形成薄皮和具有褶皺的菌落，BGDM可以用于篩選促進生物被膜形成的物質。

枯草芽胞桿菌；生物被膜；培養基；菌落；薄皮

李一平，沈漢國，喻國輝，等. 一種芽胞桿菌生物被膜形成缺陷培養基的研究［J］.廣東農業科學，2016，43（9）：98-104.

生物被膜（bioflim）是指微生物為了適應環境，粘附于非生物或活性組織表面，分泌大量的多糖、蛋白質和核酸等不均一的胞外基質，將菌體自身包裹在其中而形成的大量菌體聚集膜樣物［1］。近年來針對枯草芽胞桿菌的生物被膜形成及其機理開展了大量的研究［1-3］。組成枯草芽胞桿菌生物被膜的胞外基質包括多糖［4］和蛋白質［5］，生物被膜形成后可賦予枯草芽胞桿菌適應干燥或其他雖然存在脅迫因子但營養充足的環境［3，6-7］。

枯草芽胞桿菌生物被膜形成能力與其防治病害的能力相關。枯草芽胞桿菌6051菌株的突變體失去生物被膜形成能力后不能在擬南芥根系定殖，失去了防治丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv tomato）DC3000菌株引起病害的能力［8］。枯草芽胞桿菌NCD-2能夠防治棉花立枯病，敲除與生物被膜形成相關的基因ywbB后，菌株生物被膜形成能力下降，并降低了對棉花立枯病的防治效果［9］。枯草芽胞桿菌UMAF6614失去產生表面活性素的能力后引起生物被膜形成能力和在甜瓜葉片表面定殖能力受損，相應的防病能力也顯著降低［10］。

枯草芽胞桿菌R31是一種具備香蕉枯萎病生物防治能力的植物內生菌［11］，要篩選一些能夠促進R31生物被膜形成的物質作為增效因子來提高R31在香蕉根際定殖，需要尋找一種合適的培養基來開展相關的研究。實驗室內主要采用觀察芽胞桿菌菌株在固體表面形成菌落（colony）和液體表面形成薄皮（pecille）［2］的形態差異來判斷生物被膜形成能力的變化，使用最多的是MSgg培養基［12］，大部分野生型芽胞桿菌能夠在MSgg培養基上形成具有褶皺的菌落和薄皮。除了MSgg培養基外，用于評估枯草芽胞桿菌生物被膜形成能力的培養基還有BGM（biofilm growth medium）培養基［6］。MSgg培養基能夠促進大多數芽胞桿菌形成生物被膜，不適合篩選對生物被膜具有促進效果物質及其濃度的研究。Shemesh等［13］發現在LB培養基中加入甘油和Mn后可以促進枯草芽胞桿菌3610菌株在LB培養基上形成薄皮和褶皺的菌落。枯草芽胞桿菌R31可以在LB培養基上形成生物被膜，為了獲得一種生物被膜形成缺陷培養基用于評估和篩選影響枯草芽胞桿菌R31生物被膜形成的物質，本研究通過比較生防枯草芽胞桿菌R31菌株和168菌株在不同培養基上的生物被膜形成差異，獲得R31和168生物被膜形成能力數據，然后根據R31在不同培養基中的生長差異在BGM的基礎上設計出BGM1和BGDM（biofilm growth defective medium），并根據R31和168菌株在BGM1和BGDM培養基上的生物被膜形成情況，確定該培養基的確不支持枯草芽胞桿菌形成薄皮和具有褶皺的菌落，最后選擇了幾種具有生防能力的芽胞桿菌開展生物被膜形成驗證，確定設計出的培養基的確不支持芽胞桿菌的生物被膜形成，然后在BGDM中添加甘油或Mn離子驗證了兩種物質對R31被膜形成的促進作用。研究獲得的培養基可以用于篩選促進生物被膜形成的物質。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試菌株：枯草芽胞桿菌（Bacillus subtlis）R31［11］、TR21［14］、168，解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）R21g9［15］、短芽胞桿菌L1（Brevibacillus sp.）、膠質芽胞桿菌（B. mucilaginosus）L2［16］等菌株均由珠海市現代農業發展中心植物保護研究室保存。

供試培養基：MSgg培養基［12］，BGM培養基［6］，LB培養基，NB培養基。BGM1培養基：將BGM培養基中的酵母提取物換為牛肉膏3 g。BGDM培養基：將BGM1培養基中的胰蛋白胨換成同樣濃度的細菌學蛋白胨。在以上液體培養基中加入1.5%的瓊脂粉制備固體培養基。

1.2試驗方法

1.2.1R31和168 菌株在不同培養基上生物被膜形成觀察 將R31或168保藏液在LB固體平板上劃線活化后，挑單菌落接種于5 mL LB液體培養基中于37℃，200 r/min振蕩培養過夜，使OD600值達到0.8以上，然后用新鮮的LB培養基稀釋菌液，使菌液的OD600達到0.02，用作菌種液。滅菌后的待測液體培養基（MSgg、BGM、NB、LB、BGM1和BGDM）按照15 mL左右每支平板的量加入無菌平板或2 mL的量加入24孔細胞培養板中，將菌種液9 μL或2 μL滴加在培養液的表面，蓋上皿蓋后30℃靜置培養72 h，對形成的薄皮拍照。

在待測培養基中加入1.5%瓊脂制成固體培養基（MSgg、BGM、NA、LB、BGM1和BGDM），倒平板后吹干，將菌種液5 μL滴加在平板中央，30℃靜置培養72 h，對形成的菌落拍照。

1.2.2R31菌株在不同培養基中的生長曲線和生長方式觀察 將R31保藏液在LB固體平板上劃線活化后，挑單菌落接種于5 mL LB液體培養基中于37℃、200 r/min振蕩培養過夜，按1%的接種量轉接到100 mL 待測培養基（MSgg、BGM、NB、BGM1和BGDM）中，37℃、200 r/ min振蕩培養，以未接種的待測液體培養基作空白對照，取不同培養時間的菌液在600 nm波長下進行光電比濁測定，以不同培養時間細菌懸浮液的OD值為縱坐標，以培養時間為橫坐標，繪制生長曲線。同時取不同時間的菌液制片，結晶紫染色，在油鏡下觀察菌體生長方式。NB和BGDM培養基中菌體較少或以游離形式存在，用結晶紫染色觀察效果不明顯，因此制片后未染色。

1.2.3待測菌株在BGM1和BGDM培養基上生物被膜形成測定 測定方法同1.2.1。

1.2.4甘油和Mn離子對R31在BGDM培養基上生物被膜形成的影響 測定方法同1.2.1。在BGDM培養基中分別加入1%甘油、80 μg/mL MnSO4、1%甘油+80 μg/mL MnSO4以測定甘油和Mn離子單獨或組合對R31生物被膜形成的影響。

試驗數據采用Excel 2003軟件進行處理，并繪制生長曲線。

2　結果與分析

2.1R31和168菌株在不同培養基上的生物被膜形成觀察

枯草芽胞桿菌R31菌株可以在LB、NA和MSgg固體培養基上形成具有褶皺和突起的菌落，但在固體BGM培養基上形成的褶皺不明顯；168菌株不能在LB、NA、MSgg和BGM上形成具有褶皺的菌落（圖1A，彩插一）。R31可以在LB、NA、MSgg和BGM上形成完整的薄皮（圖1B彩插一），其中在MSgg上形成的薄皮具有皺褶；168菌株也可以在LB和MSgg上形成無褶皺的薄皮，在NB和BGM上形成的薄皮存在一定缺陷。由圖1可知，基于枯草芽胞桿菌R31和168菌株在4種培養基上的生物被膜形成狀況可知枯草芽胞桿菌R31菌株的生物被膜形成能力比168菌株強。

2.2R31菌株在不同培養基中的生長曲線和生長方式觀察

由圖2可知，R31菌株在BGM培養基中沒有明顯的遲滯期（圖2A），對數生長期從0 h到18 h；R31在MSgg和NB均有明顯的遲滯期（圖2B），其中在MSgg培養基中的遲滯期約2.5 h，在NB中則達到了3.5 h。R31菌株在MSgg培養基中生長迅速，在6.5 h結束對數生長，但在NB培養基中對數生長期到10 h結束，說明R31菌株在MSgg培養基中的菌體濃度比在NB中高。

圖2　R31菌株在不同培養基中的生長曲線

R31菌株在DSM培養基中的生長方式見圖3（彩插一）。在顯微鏡下觀察，發現R31菌株在該培養基中培養1.5 h，菌體形成長桿狀結構；培養2.5 h菌體同時出現長桿狀和短桿狀，并且出現黏連；培養3 h菌體的桿狀長度開始變短，菌體聚合度進一步增加；培養3.5 h菌體全部呈現短桿狀，并聚集形成網狀雛形；培養4 h菌體大量聚集，形成有空洞的網格結構；培養4.5 h菌體形成致密的、規則的中空網狀結構。

R31菌株在MSgg培養基中的生長方式見圖4（彩插一）。培養2.5～4.5 h菌體均以短桿狀方式生長，培養5.5 h可觀察到短桿狀的菌體開始聚集，隨著時間的延長，聚集越來越明顯，并最終形成具有中空的網狀結構，培養10 h菌體在顯微鏡下顯示出網絡狀結構。

R31菌株在NB培養基中完全以游離狀態生長，其生長過程見圖5（彩插一）。培養1.5 h，僅觀察到有少量長桿狀游離菌體；培養2.5 h，菌體密度有所增加，大部分菌體以短桿狀出現，偶然見到長桿狀游離菌體；此后所有時間點的觀察結果都顯示，R31菌株在NB培養基中以游離的狀態生長，不出現聚集和鏈狀結構。

此外，王燕等［17］的研究顯示，R31在LB中能夠快速生長，生長速度與在MSgg中的相當，并且生長方式也與MSgg類似，菌體培養8 h形成三維網狀結構。基于R31在BGM、LB和NB培養基中的生長差異，說明不同培養基中的營養差異可能是引起菌體生長差異的原因。因此以BGM培養基為基礎，將其中的酵母提取物換成牛肉膏得到BGM1培養基，將BGM1中的胰蛋白胨換成細菌性蛋白胨，形成BGDM培養基。

圖6　R31菌株在BGM1和BGDM培養基中的生長曲線

2.3R31菌株 在BGM1和BGDM中的生長曲線

測定R31菌株在BGM1和BGDM培養基中的生長曲線（圖6），發現R31在BGM1培養基上可以正常生長，延緩期約2 h，此后迅速生長，但在BGDM培養基中不能正常生長，遲滯期長達15 h。說明兩種不同的蛋白胨影響了R31的生長。在顯微鏡下觀察，R31在BGM1和BGDM培養基中的生長方式見圖7（彩插二）。在顯微鏡下觀察，發現R31在該培養基中培養2.5 h，菌體相互黏連；培養3.5 h，菌體出現長桿狀和網狀結構；培養4.5 h，菌體的聚合度進一步增加；培養5.5 h，菌體大量聚集；培養7.5 h，菌體形成有空洞的網格結構；培養8.5 h，菌體形成致密的、規則的中空網狀結構。R31菌株在BGDM培養基中以游離方式生長（圖8，彩插二），與R31在NB培養基中的生長方式類似。

2.4R31和168菌株在BGM1和BGDM中生物被膜形成差異

R31和168菌株在BGM1和BGDM培養基中形成的生物被膜存在明顯差異（圖9，彩插二）。生物被膜形成能力弱的168菌株不能在BGM1中形成明顯的菌落，在BGM1液體培養基上形成的薄皮不能覆蓋整個平板，不能在BGDM培養基中形成明顯的菌落和薄皮。R31的生物被膜形成能力比168強，能夠在BGM1培養基中形成穩定的薄皮和表面具有突起的菌落，但不能在BGDM培養基中形成薄皮，在BGDM培養基上形成的菌落光滑無突起。從168和R31菌株在BGM1和BGDM培養基上形成生物被膜的能力和形成薄皮的結構差異來看，BGDM培養基不支持枯草芽胞桿菌生物被膜的形成。

2.5幾種待測芽胞桿菌菌株在BGM1和BGDM中生物被膜形成差異

待測菌株在BGM1和BGDM上形成的薄皮和菌落形態存在明顯差異。由圖10（彩插二）可知，待測菌株可以在BGM1固體培養基上形成具有不同程度突起的菌落（圖10A，彩插二），在BGDM培養基上僅能形成光滑的菌落；所有待測菌株均能在BGM1上形成薄皮（圖10B，彩插二），不同菌株長出的薄皮厚度存在差異，R21g9和L1形成的薄皮最厚，其次為L2，枯草芽胞桿菌TR21菌株在BGM1上形成的薄皮最薄；所有菌株在BGDM上均不能形成完整的薄皮，R21g9的形成較厚的漂浮物但不能鋪滿整個平板，TR21能形成薄的漂浮物，也不能鋪滿整個平板，另外2株芽胞桿菌則完全不能形成薄皮。

待測菌株分別屬于枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、膠質芽胞桿菌和短芽胞桿菌，不同類型的芽胞桿菌均不能在BGDM上形成薄皮，顯示BGDM培養基抑制芽胞桿菌薄皮形成可能在產芽胞細菌中是保守的。

2.6甘油和Mn對R31在BGDM上生物被膜形成的影響

為了進一步驗證篩選獲得的BGDM是否適合用于生物被膜形成促進物質篩選，選擇2種已經證明可以促進芽胞桿菌生物被膜形成的物質甘油和Mn，在BGDM中添加甘油和Mn可以恢復R31薄皮的形成（圖11，彩插二），R31在BGDM中不能形成薄皮，但在BGDM中加入1%的甘油可以形成褶皺十分明顯的薄皮。R31在BGDM中形成光滑的菌落，加入1%的甘油后，菌落表面出現突起。Mn離子單獨添加能夠恢復R31在BGDM中薄皮的形成，但形成的薄皮不具備皺褶，形成的菌落也不具備皺褶但具備擴散性狀。在BGDM培養基中同時加入甘油和Mn后，可以觀察到R31的菌落和薄皮的形態發生變化，薄皮的皺褶更加明顯，菌落除了具備擴散特性外，還長出微弱突起。

3　結論與討論

用于土傳病害生物防治的芽胞桿菌如果能夠在作物根際快速形成生物被膜并長期定殖，有利于病害的防治。本試驗通過比較廣譜抗真菌枯草芽胞桿菌R31在不同培養基中生長和生物被膜形成的差異，發現培養基類型影響其生長和生物被膜的形成，并在此基礎上設計出BGM1和BGDM培養基，通過比較R31和168菌株在BGM1和BGDM上生物被膜形成能力變化，發現BGDM培養基不支持枯草芽胞桿菌形成薄皮和具有褶皺的菌落。為了進一步驗證這一現象是否為產芽胞細菌中的保守現象，還測試了其他幾株廣譜抗真菌芽胞桿菌在BGM1和BGDM上形成生物被膜的差異，發現被測定的芽胞桿菌菌株可以在BGM1上形成薄皮和表面有突起的菌落，但不能在BGDM培養基上形成穩定的薄皮和具有突起的菌落。在BGDM培養基中加入甘油或/和Mn后能夠恢復R31生物被膜的形成。本試驗結果表明，不同菌株在BGM1和BGDM培養基上生物被膜形成能力的差異顯示這種對蛋白胨利用的差異可能是產芽胞細菌中的保守功能，可以利用BGDM培養基來開展促進生物被膜形成物質的篩選和評估。

枯草芽胞桿菌168菌株是一種實驗室馴化的芽胞桿菌，其生物被膜形成能力退化，而枯草芽胞桿菌R31是一種野生型枯草芽胞桿菌，具有較強的生物被膜形成能力，這兩株芽胞桿菌在不同培養基中的生物被膜形態存在較大差異，主要表現為薄皮的厚度以及菌落的褶皺情況。LB、NB、BGM、MSgg培養基都支持R31菌株形成薄皮和具褶皺的菌落，支持168形成薄皮，但不支持168形成具有褶皺的菌落，尤其是MSgg培養基，R31和168菌株形成的菌落存在顯著差異，R31在MSgg上形成與NCBI3610類似的菌落，但形成的薄皮不如3610的褶皺明顯［12］。

對枯草芽胞桿菌搖瓶生長方式的觀察發現R31菌株在不同培養基中的生長方式存在差異，R31僅在NB培養基中以游離的狀態生長，在LB［17］、MSgg和BGM中均顯現出生物被膜形成時的生長特性，如生長早期菌體之間連接形成長桿狀，生長中后期菌體之間大量聚集并形成網狀結構，這些觀察結果與NCBI3610在靜置培養形成生物被膜時的生長方式一致［12］，說明影響枯草芽胞桿菌生長方式的不是培養方式而是營養類型，尤其是蛋白質的類型。

枯草芽胞桿菌可以通過KinD蛋白激酶的胞外結構域識別甘油［13］，并激發Spo0A磷酸化，最終激發epsA-O操縱子和tapA操縱子表達，其中epsA-O操縱子編碼胞外多糖EPS生物合成所需的酶［4］，而tapA操縱子則合成組成胞外基質的淀粉樣蛋白TasA［5］。Shemesh和 Chai［13］發現KinD的胞外結構域并不能識別Mn，但是單獨添加甘油卻無法刺激3610在LB中形成具有褶皺的薄皮和菌落，單獨添加Mn也無法刺激3610在LB中形成具有褶皺的菌落和薄皮，顯然Mn離子通過一種未知的途徑激發了3610在LB中的生物被膜形成。BGM培養基以LB為基礎，R31在這個培養基中可以形成薄皮和表面具有微弱褶皺的菌落，當BGM中的LB換成NB后，R31不僅不能正常的形成薄皮和具有褶皺的菌落，生長也受到了抑制，遲滯期長達12 h以上。在BGDM中添加Mn離子或甘油或同時添加2種物質，可以顯著促進R31的薄皮形成，但不同物質在對菌落形態方面的影響存在差異，單獨添加甘油增加了BGDM培養基上菌落的突起，而單獨添加Mn則使菌落具備擴散形態。同時增加甘油和Mn時，菌落增加了褶皺和擴散。顯然甘油和Mn離子通過不同的途徑在影響BGDM中R31的生長。BGM1和BGDM培養基唯一的差異為蛋白胨的類型，結合R31在兩者中的生長方式差異，可能Mn離子添加促進了R31對胞外蛋白的利用，這需要進一步驗證。

生物被膜形成能力的強弱能夠影響菌株在植物根際的定殖并對防效產生影響，在篩選生防微生物時，除了采用傳統的方法評價菌株對病原菌的廣譜拮抗活性外，可以考慮增加生物被膜形成能力評估，可能有利于提高生防菌篩選效率和田間防治效果。如枯草芽胞桿菌R31菌株是一株廣譜抗菌植物內菌［17］，能夠形成生物被膜［18］，能夠在香蕉和粉蕉的根表、根際土、根和球莖中長期定殖［19］，在巴西蕉中的研究發現，R31接種后60 d在根表的定殖量是接種后1 d的2.8倍［19］，而TR21在巴西蕉根際接種后15 d，根表定殖的菌量為接種后1 d 的2.07 ×10-4倍［20］。R31在大田與香蕉抗病品種結合的防效達到81.86%［21］，與TR21在同一塊地同一種濃度開展防效驗證時對巴西蕉枯萎病的防治效果［22］顯著高于TR21菌株［23］，第一年度R31和TR21對巴西蕉枯萎病的防治效果分別為82.40%和63.23%，第二年度R31和TR21對巴西蕉枯萎病的防治效果分別為94.35%和73.90%。本研究發現兩者的生物被膜形成能力也存在明顯的差異，R31在BGM中能夠形成厚的薄皮和具有褶皺的菌落，而TR21僅能夠形成薄的薄皮，形成的菌落也不具備褶皺。

［1］劉偉杰，劉聰，蔣繼宏. 枯草芽胞桿菌形成生物被膜的研究進展［J］. 微生物學報，2014，54（9）：977-983.

［2］Lemon K P，Earl A M，Vlamakis H，et al. Biofilm development with an emphasis on Bacillussubtilis［J］. Current Topics in Microbiology and Immunology，2008，322：1-16.

［3］Mielich-Suss B，Lopez D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation［J］. Environmental Microbiology，2015，17（3）：555-565.

［4］Chagneau C，Saier J M H. Biofilm-defective mutants of Bacillus subtilis［J］. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，2004，8（3）：177-188.

［5］Branda S S，Chu F，Kearns D B，et al. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix［J］. Molecular Microbiology，2006，59（4）：1229-1238.

［6］Hamon M A，Lazazzera B A. The sporulation transcription factor Spo0A is required for biofilm development in Bacillus subtilis［J］. Molecular Microbiology，2001，42（5）：1199-1209.

［7］Morikawa M. Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering，2006，101（1）：1-8.

［8］Bais H P，Fall R，Vivanco J M. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production［J］. Plant Physiology，2004，134（1）：307-319.

［9］郭慶港，吳園園，李社增，等. ywbB基因對枯草芽胞桿菌NCD-2菌株生物膜形成和根際定殖能力的影響［J］. 植物保護學報，2013，40（1）：45-50.

［10］Zeriouh H，de Vicente A，Perez-Garcia A，et al. Surfactin triggers biofilm formation of Bacillus subtilis in melon phylloplane and contributes to the biocontrol activity［J］. Environmental Microbiology，2014，16（7）：2196-2211.

［11］喻國輝，程萍，王燕鸝，等. 一株香蕉枯萎病生防芽胞桿菌的鑒定、生物學特性和抗菌譜研究［J］. 中國農學通報，2010，26（12）：216-220.

［12］Branda S S，Gonzalez-Pastor J E，Dervyn E，et al. Genes involved in formation of structured multicellular communities by Bacillus subtilis［J］. Journal of Bacteriology，2004，186（12）：3970-3979.

［13］Shemesh M，Chai Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling［J］. Jounal of Bacteriology，2013，195（12）：2747-2754.

［14］周林，程萍，沈漢國，等. 1株廣譜抗真菌芽胞桿菌TR21的鑒定［J］. 熱帶作物學報，2010，31（4）：605-609.

［15］陳燕紅，陳遠鳳，黎永堅，等. 一株香蕉枯萎病生防解淀粉芽胞桿菌的分離、鑒定及其拮抗物質研究［J］. 廣東農業科學，2013，40（2）：68-72.

［16］牛春艷. 分解黑水虻蛹皮的產幾丁質酶生防芽胞桿菌篩選、鑒定和產酶特性研究［D］. 廣州：中山大學，2011.

［17］王燕，程萍，喻國輝. 枯草芽胞桿菌R31的原生質體制備方法優化［J］. 廣東農業科學，2015，42（24）：107-110.

［18］李榮. 枯草芽胞桿菌R31對香蕉枯萎病生防機制研究［D］. 武漢：華中農業大學，2012.

［19］李榮，程萍，喻國輝，等. 枯草芽胞桿菌R31在香牙蕉根部的定殖能力測定［J］. 廣東農業科學，2011，38（24）：59-61，68.

［20］周林，程萍，喻國輝，等. 枯草芽胞桿菌TR21在香蕉體內及根際的定殖動態［J］. 中國農學通報，2010，26（19）：392-396.

［21］黎永堅，程萍，喻國輝，等. 枯草芽胞桿菌R31和TR21菌株防治香蕉枯萎病田間藥效試驗［J］. 廣東農業科學，2012，39（23）：70-72.

［22］喻國輝，黎永堅，陳燕紅，等. 一株廣譜抗真菌植物內生枯草芽胞桿菌及其應用［P］. 中國：發明專利，ZL 200910214430.2.

［23］喻國輝，程萍，王燕鸝，等. 枯草芽胞桿菌TR21田間防治巴西蕉枯萎病的效果［J］. 中國生物防治，2010，26（4）：497-500.

（責任編輯 鄒移光）

Study on a bacillus biofilm growth defective culture medium

LI Yi-ping，SHEN Han-guo，YU Guo-hui，WANG Yan，LI Chi，YE Zhi-wen，ZHOU Dong-hui，WU Xu-bo
（Zhuhai Modern Agriculture Development Center，Zhuhai 519070，China）

To find a culture medium could not support bacillus biofilm formation，the colony and pellicle morphological differences of Bacillus subtilis stain R31 and 168 in solid and liquid MSgg，NB，LB and BGM medium were compared to make sure the biofilm formation difference of the two strains. Based on the different growth process of R31 in liquid MSgg，NB and BGM on shaking cultivation，two culture mediums were designed and named BGM1 and BGDM. The growth curve and process of R31 in BGM1 and BGDM were checked and the colony and pellicle morphological differences of R31 and 168 developed in BGM1 and BGDM were compared. Finally，the biofilm morphological differences of B. subtilis strain TR21，B. amyloliquefaciens strain R21g9，Brevibacillus sp. strain L1 and B. mucilaginosus strain L2 in BGM1 and BGDM were studied. Results showed that R31 could develop integrated pellicle in liquid MSgg，NB，LB and BGM medium，and develop wrinkle colony in solid MSgg，LB and NAmedium，but develop smooth colony in solid BGM medium. The biofilm of R31 in these mediums were more robust than that of 168. The cells of R31 grew freely in MSgg and BGM medium in the early stage （2 h） of cultivation，the cells attached to each other and linked like a chain in logarithmic phase （4 h），and the cell morphology looked like a net in the end of logarithmic phase （8 h），but R31 cells grew freely in NB culture medium at the whole growth process. These results showed that nutrition but not cultural condition affected the growth process of R31. So the yeast extract in BGM was changed as beef extract and the medium named BGM1，and tryptone of BGM1 was changed as peptone and the medium was named BGDM. R31 and 168 could develop pellicle and colony in BGM，but all couldn’t develop pellicle and winkle colony in BGDM medium. All the tested bacillus strains could develop integrated pellicle with different thickness and wrinkle colony in BGM1，but they all could not develop integrated pellicle and wrinkle colony in BGDM medium. Glycerol or Manganese were added in BGDM could recover the integrated pellicle and wrinkle spread colony formation of R31. Bacillus strains could not develop normal pellicle and winkle colony in BGDM medium，and this medium could be used to select the materials.

Bacillus subtilis；biofilm；culture medium；colony；pecille

S482.2+92

A

1004-874X（2016）09-0098-07

2016-06-07

廣東省科技計劃項目（2014A020208015）

李一平（1974-），男，高級農藝師，E-mail：425024563@qq.com

喻國輝（1976-），男，博士，研究員，E-mail：ygh76411@163.com