桑葉農藥殘留的酶抑制速測與生物檢測比較

董久鳴，孫海燕，陳偉國，楊一平，張　芬

（1.浙江省農業技術推廣中心，浙江 杭州 310020； 2.海寧市蠶桑技術服務站，浙江 嘉興 314400）

桑葉農藥殘留的酶抑制速測與生物檢測比較

董久鳴1，孫海燕2，陳偉國2，楊一平2，張芬2

（1.浙江省農業技術推廣中心，浙江 杭州 310020； 2.海寧市蠶桑技術服務站，浙江 嘉興 314400）

采用家蠶生物毒性測定方法驗證CL-BⅢ殘留農藥測定儀檢測桑葉農藥殘留，建立了兩種方法對十余種常用有機磷和氨基甲酸酯類農藥的對應關系。結果表明：隨著桑葉添毒時間的延長，家蠶死亡率和殘留農藥測定儀的檢測抑制率均呈現下降趨勢，絕大部分農藥對家蠶的死亡率與檢測抑制率之間同步性較好，但乙酰甲胺磷的檢測抑制率明顯偏低，易出現假陰性結果。因此，酶抑制速測法可作為養蠶前桑葉農藥殘留粗篩檢測，也可在家蠶中毒事故發生后作為判斷農藥種類的快速檢測方法。

農藥殘留；快速檢測；酶抑制法；生物檢測

桑葉是家蠶的唯一飼料，在生長、采摘、運輸、貯藏和飼喂過程中均有可能受農藥污染，導致家蠶中毒造成經濟損失，其中以桑園或周邊農作物施用農藥污染桑葉最多［1］。因此檢測桑葉農藥殘留是保障養蠶生產安全的主動預防措施，由于氣相色譜、液相色譜等農藥殘留檢測方法儀器昂貴、技術要求高、耗時過長，難以在農業生產中普及應用。目前技術指導的主要預防措施是要求蠶農采取提前試喂桑葉，但存在缺少試材、耗時較長等問題，在生長忙季往往被忽視。

近年來，基層農技推廣部門已普及酶抑制快速檢測儀器，廣泛應用于蔬菜、水果等農產品質量安全檢測，能夠檢測目前農作物使用量最大的有機磷和氨基甲酸酯兩大類農藥［2-6］。鑒于此，我們對農藥殘留速測儀應用于桑葉農殘檢測進行了系統試驗研究，尤其是針對桑葉樣品容易出現假陽性等問題優化了桑葉的前處理方法，建立了CL-BⅢ殘留農藥測定儀桑葉標準對照庫［7］。為進一步驗證CL-BⅢ殘留農藥測定儀檢測桑葉樣本的實際效果，采用與養蠶生物毒性同步的對比方法，明確了10余種農藥的儀器檢測結果與生物毒性的對應關系，為酶抑制快速檢測方法應用于蠶桑生產的安全防范提供參考。

1　材料與方法

1.1供試材料

1.1.1儀器

CL-BⅢ八通道殘留農藥測定儀（上海復博農業科技有限公司）；電子天平，精確度0.1 g；可調移液槍，2～100 μl，50～5000 μl；其它玻璃儀器。

1.1.2試劑

CL-BⅢ殘留農藥測定儀配套試劑：提取液，酶試劑，顯色劑，底物，由上海復博農業科技有限公司提供。

1.1.3供試桑樹

海寧市蠶桑技術服務站試驗桑園，強桑1號品種，5年生，低桿養成，每667 m2桑園栽600株。

1.1.4供試家蠶

蠶品種為白玉×秋豐，浙江省海寧市新興蠶種制造有限公司生產，按照試驗時間要求，在實驗室內按常規方法飼養到3齡起蠶，備用。

1.1.5供試農藥

有機磷農藥7種，氨基甲酸酯類農藥3種，兩類農藥混配4種，見表1。

1.2試驗方法

1.2.1噴藥方法

將供試農藥按表1濃度稀釋成藥液，在海寧市蠶桑技術服務站試驗桑園內噴藥，每種藥劑噴5株桑樹，采用農邦WBS-16L-A手動噴霧器，藥液均勻噴濕桑葉正反面，噴藥桑樹四周至少間隔2株桑樹作為保護行。噴藥在傍晚進行，噴藥后24 h內無雨。

1.2.2采葉時間

根據預備試驗結果，確定不同供試農藥噴于桑樹后的殘毒檢測和養蠶采葉間隔時間。試驗檢測開始后以每天為1個處理，采摘桑葉后先取樣供農殘速測儀檢測，余葉用于養蠶試驗，補喂桑葉均采摘農藥處理桑葉，持續飼養1個齡期，直至不再出現中毒、死亡為止。

1.2.3養蠶方法

從3齡起蠶開始喂飼各農藥處理的桑葉，以新鮮無毒桑葉為對照處理，每小區30頭蠶，重復3次，逐日調查記載各小區死亡蠶頭數。

1.2.4檢測方法

桑葉樣品檢測的前處理方法為：從成熟桑葉葉尖部分剪取整塊，并稱準2 g，將葉背朝上從剪斷面向葉尖卷成直徑1 cm左右的管狀，然后將其盤成圈后放入提取瓶中，加入10 ml提取液，浸泡15 min，大致均分3個時段搖晃提取瓶，每次搖晃10下。后續檢測按CL-BⅢ殘留農藥測定儀常規方法操作，選擇標準對照庫中的桑葉。每個樣品重復檢測3次，保存儀器檢測的抑制率數據。檢測結果以CL-BⅢ殘留農藥測定儀顯示合格（抑制率＜50%）為參照標準。

2　結果與分析

2.1桑葉農藥殘留檢測抑制率與生物毒性對應關系

從圖1可見，14組農藥殘留抑制率與家蠶中毒死亡率均隨著噴藥后間隔時間延長而下降，但不同農藥的下降速率差異較大。圖1（a）辛硫磷1000倍與圖1（b）辛硫磷1000倍+敵敵畏1000倍，噴藥后1 d的抑制率與死亡率接近100%；噴藥后2～4 d的抑制率均高于50%，死亡率則快速下降；噴藥后5～7 d的抑制率均下降到50%以下，死亡率全部為零；圖1（b）雖然在圖1（a）的基礎上增加了敵敵畏，但抑制率僅略有提高，死亡率相近，表明辛硫磷起主導作用。圖1（c）敵敵畏1000倍，噴藥后1～3 d的抑制率均低于50%，死亡率均為零，也印證了圖1（b）的結果。

表1　14種供試農藥Table 1　14 kinds of pesticides

圖1　14組農藥處理桑葉的檢測抑制率和家蠶死亡率Figure 1　Detection inhibition rate and silkworm mortality of treated mulberry leaves with 14 kinds of pesticides

圖1（d）亞胺硫磷1000倍噴藥后1～4 d的抑制率均在80%以上，死亡率也較高；噴藥5 d后抑制率逐漸下降到50%以下，死亡率均為零；表明本方法檢測亞胺硫磷的抑制率偏高。

圖1（e）殺螟硫磷1500倍的起始抑制率64.27%，隨著時間推移緩慢下降，表明本方法檢測殺螟硫磷的抑制率偏低；圖1（f）在圖1（e）的基礎上增加了辛硫磷1000倍，起始抑制率高達99.86%，噴藥后5 d快速下降到58.17%，但兩者的生物毒性表現一致；表明辛硫磷是推高圖1（f）抑制率的主要因素，而真正導致家蠶死亡率高的是殺螟硫磷的作用。圖1（e）殺螟硫磷噴藥后8 d死亡率為零，而圖1（f）噴藥后10 d死亡率為零，表明這兩種有機磷農藥混用后可能導致殘毒期延長。

圖1（g）滅多威1500倍與圖1（h）滅多威1500倍+辛硫磷1000倍的起始抑制率都在95%以上，表明本方法檢測滅多威的抑制率偏高；兩組農藥的死亡率與抑制率均有較高對應關系。殘殺威與滅多威同為氨基甲酸酯類農藥，圖1（i）殘殺威1500倍與圖1（j）殘殺威1500倍+辛硫磷1000倍試驗結果與圖1（g）和圖1（h）相似，但在桑葉上的殘毒期略有延長。

圖1（k）敵百蟲1500倍起始抑制率較高，隨時間推移抑制率和家蠶死亡率均逐漸下降，檢測結果與生物毒性的對應關系良好，殘毒期約11 d。

圖1（l）毒死蜱1500倍在桑葉上的降解較慢，噴藥后14 d對3齡家蠶的死亡率仍達到100%，檢測抑制率達到84.56%；因此檢測從噴藥后13 d開始，噴藥后22 d對家蠶無中毒致死作用，檢測抑制率下降到41.15%。

圖1（m）乙酰甲胺磷1500倍在桑葉上的殘毒期較長，噴藥后13～23 d的家蠶死亡率從60.00%下降到0，但抑制率從50.19%下降到36.70%，即抑制率在50%以下時仍然對家蠶有較高的生物毒性，表明本方法對乙酰甲胺磷靈敏度較低。

圖1（n）丁硫克百威1500倍是供試農藥中殘毒期最長的，噴藥后13 d的家蠶死亡率75.00%，抑制率高達95.40%，表明本方法對丁硫克百威靈敏度較高；噴藥后29 d對家蠶無中毒致死作用。

2.2生物毒性與檢測結果的對比校正

由表2可見，14組農藥處理的桑葉飼喂3齡起蠶無中毒間隔天數與桑葉農殘速測抑制率＜50%的天數對比，77.5%敵敵畏乳油1000倍等9組吻合，20%亞胺硫磷乳油1000倍的養蠶無中毒天數比檢測合格天數短1d，20%滅多威乳油1500倍+40%辛硫磷乳油1000倍、8%殘殺威可濕性粉劑1500倍、480 g/L毒死蜱乳油1500倍的養蠶無中毒天數比檢測合格天數長1 d，而30%乙酰甲胺磷乳油1500倍的養蠶無中毒天數比檢測合格天數長9 d。

表2　14組農藥處理桑葉的檢測抑制率和養蠶死亡率Table 2　Detection inhibition rate and silkworm mortality of treated mulberry leaves with 14 kinds of pesticides

此外，從表2還可看出，辛硫磷與滅多威、殘殺威、殺螟硫磷混配后比單劑的生物毒性時間延長。

3　小結與討論

CL-BⅢ殘留農藥測定儀檢測桑葉農藥殘留，其抑制率與家蠶生物毒性測定結果高度相關，檢測抑制率和家蠶死亡率均隨著農藥處理后時間的推移而下降。但對乙酰甲胺磷的檢測抑制率明顯短于實際的生物毒性，表明其反應靈敏度較差。

由于儀器檢測的酶抑制率以比色法吸光度的變化計算而來，植物體的內容物會對酶反應產生干擾，檢測液的顏色會有變化，可能影響檢測結果可靠性［3，8］。因此，CL-BⅢ殘留農藥測定儀電腦版專門提供了檢測不同蔬菜的校正曲線，但桑葉未列入其中，本試驗按照CL-BⅢ殘留農藥測定儀檢測桑葉農藥殘留前處理方法操作［7］，并以家蠶生物毒性測定方法進行驗證。

桑葉農藥殘留關系到能否安全養蠶，酶抑制法作為一種快速檢測技術有其方便、快捷、覆蓋農藥種類廣等優點，但也存在對不同農藥的反應靈敏度差異等問題。在現實條件下，高精檢測儀器尚無法用于農業生產，CL-BⅢ殘留農藥測定儀等快速檢測設備已經普遍應用于農產品生產和流通環節。探索桑葉農藥殘留的快速檢測技術，能夠充分利用現有設備，為養蠶安全提供有效的輔助手段。本試驗初步建立了CL-BⅢ殘留農藥測定儀檢測桑葉農藥殘留抑制率與養蠶生物毒性的數據對比，涉及常用的10種常用有機磷和氨基甲酸酯類農藥單劑和4種復配組合，供預防養蠶農藥中毒參考，也可供中毒事故發生后的初步定性。

［1］ 魯興萌.養蠶中毒的原因分析和防范［J］.蠶桑通報，2008，39（1）：1～5.

［2］ 胡蓉.酶抑制法在蔬菜農藥殘留快速檢測中的應用［J］.辣椒雜志，2013（4）：42～44.

［3］ 杜美紅，孫永軍，汪雨，等.酶抑制-比色法在農藥殘留快速檢測中的研究進展［J］.食品科學，2010，31（17）：462～466.

［4］ 欒云霞，李楊，平華，等.基于酶抑制法的農藥殘留快速檢測儀器現狀及評價［J］.食品安全質量檢測學報，2012，3（6）：690～694.

［5］ 戴慧峰，石國忠，范麗.CL-BⅢ型八通道農殘速測儀農藥檢出限試驗研究［J］.上海農業科技，2012（1）：32.

［6］ 孫民.CL-BⅢ殘留農藥測定儀快速測定蔬菜農殘技術［J］.長江蔬菜，2011（23）：34～35.

［7］ 孫海燕，陳偉國，董久鳴，等.酶抑制速測儀檢測桑葉農藥殘留的前處理方法優化［J］.蠶桑通報，2015，46（4）：20～23.

［8］ 裘正軍，陸江峰，何.勇基于酶抑制法的農產品農藥殘留快速檢測系統及影響因素分析［J］.農業工程學報，2007，23（9）：229～233.

Enzyme Inhibition Detection of Pesticide Residues on Mulberry Leaves and Compared With Biological Detection

DONG Jiu-ming1，SUN Hai-yan2，CHEN Wei-guo2，YANG Yi-ping2，ZHANG Fen2
（1.Extension Center for Agricultural Technology of Zhejiang Province，Hangzhou 310020，China；2.Haining Sericulture Technology Service Station，Jiaxing 314400 Zhejiang，China）

This article mainly validated the detection of pesticide residues in mulberry leaves by CL-BⅢ with detection of biological toxicity of silkworm method.And the corresponding relationship between the two methods for 14 kinds of commonly used organophosphate and carbamate pesticides were established.The results showed that with the time extension of mulberry leaves with the pesticides，the silkworm mortality and detection inhibition rate of CL-BⅢwere decreased.The synchronization between silkworm mortality rate and detection inhibition rate were all good with most pesticides.However，the detection inhibition rate of Acephate was obviously low.So the enzyme inhibition detection of pesticide residues on mulberry leaves could be a fast detection method for pesticide category.

pesticide residues；fast detection；enzyme inhibition detection；biological detection

S888

A

0258-4069［2016］01-018-05

浙江省三農六方科技協作計劃中青年項目；浙江省重點科技創新團隊項目（2011R50028-19）

董久鳴（1982-），男，吉林集安人，碩士，農藝師。主要從事蠶桑科技研究及技術推廣工作。E-mail：jiuming0828@126.com