四種聚酰胺-胺樹狀大分子制劑逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥性的研究

孫冬妮，牛壘

鞍山衛(wèi)生學(xué)校藥理教研室，遼寧鞍山114001

四種聚酰胺-胺樹狀大分子制劑逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥性的研究

孫冬妮，牛壘

鞍山衛(wèi)生學(xué)校藥理教研室，遼寧鞍山114001

目的探討帶有不同電荷及配體的樹狀大分子（PAMAM）對(duì)逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞多藥耐藥（MDR）的影響。方法以阿霉素為模型藥，比較了四種載藥大分子（G 3.5/DOX，G 4.0/DOX，PEG-G 4.0/DOX，F(xiàn)A-G 4.0/DOX）對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。結(jié)果四種大分子制劑的細(xì)胞毒均高于DOX溶液，F(xiàn)A-G 4.0（6.74 μg/mL）最強(qiáng)，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)達(dá)到5.07。與大分子制劑孵育2h后，MCF-7/ADR細(xì)胞中阿霉素濃度大小為FA-G 4.0/DOX＞G 4.0/DOX≈G 3.5/DOX＞PEG-G 4.0/DOX＞DOX溶液。結(jié)論四種大分子制劑均可一定程度地克服MCF/ADR細(xì)胞的耐藥性，G 3.5/DOX、G 4.0/DOX、PEG-G 4.0/DOX對(duì)MDR的影響沒有顯著區(qū)別，F(xiàn)A-G 4.0/DOX克服MDR的效果最好。

樹狀大分子；人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞；多藥耐藥；P-gp；葉酸靶向

多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生抗藥性的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥產(chǎn)生交叉耐藥性，是最重要、最常見的腫瘤耐藥現(xiàn)象［1］。其中P-gp的過度表達(dá)是多藥耐藥形成的主要機(jī)制［2］。目前普遍解決的方法是使用P-gp抑制劑，如維拉帕米、環(huán)孢菌素A、等，P-gp抑劑能加強(qiáng)底物藥物的生物利用度，但是一般P-gp抑制劑本身具有生物活性，同時(shí)具有一定的不良反應(yīng)。近年來，眾多研究表明納米載體可以克服MDR，如脂質(zhì)體［3］、聚合物納米粒［4］、膠束載體［5］等。聚酰胺胺（PAMAM）樹狀大分子［6］作為新型的一種納米膠束給藥系統(tǒng)，具有無遺傳毒性，無免疫原性等特點(diǎn)，作者使用的PAMAM是以乙二胺為核，3.5代樹狀大分子G 3.5以酯基封端，G 4.0以氨基封端，利用G 4.0分別制備具有長(zhǎng)循環(huán)作用和葉酸靶向的樹狀大分子，初步探討了電荷和配體對(duì)MDR逆轉(zhuǎn)的影響。

1　儀器與材料

細(xì)胞株:人乳腺癌細(xì)胞MCF-7（實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)），人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADR（上海佛雷堡生物科技有限公司）。酶標(biāo)儀（TECAN SPECTRA）（德國(guó)Wetzlar公司），ARX-300型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司），Bruker vector 22型紅外光譜測(cè)定儀（瑞士Bruker公司），G 3.5/DOX，G 4.0/DOX，PEG-G 4.0/DOX，F(xiàn)A-G 4.0/DOX（自制）等。

2　方法與結(jié)果

2.1載阿霉素樹狀大分子對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)的比較

2.1.1空白樹狀大分子對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7/ADR細(xì)胞，以10 000 cells/100 μL的密度分別接種于96孔培養(yǎng)板，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24h，分別給予四種空白大分子100 μL/孔，使四種空白大分子在培養(yǎng)液中的終濃度為:1 μg/mL、5 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL。每一濃度平行3孔，培養(yǎng)48h后，每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵箱中培養(yǎng)4h后，去培養(yǎng)液，加DMSO 150 μL/孔，震蕩10 min，在波長(zhǎng)492 nm處測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率，結(jié)果見Fig.1。

Fig.1　The cytotoxicity of blank G 3.5，G 4.0，PEG-G 4.0，F(xiàn)A-G 4.0 in MCF-7/ADR

2.1.2載藥大分子對(duì)耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7/ADR細(xì)胞，以10 000 cells/100 μL的密度分別接種于96孔培養(yǎng)板，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24h，分別給予四種載藥大分子和DOX溶液100 μL/孔，使藥物在培養(yǎng)液中的終濃度為:3、9、18、24 μg/mL。每一濃度平行3孔，培養(yǎng)48h后，每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵箱中培養(yǎng)4h后，去培養(yǎng)液，加DMSO 200 μL/孔，震蕩10 min，波長(zhǎng)490 nm處測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率，結(jié)果見Fig.2。

Fig.2　The cytotoxicity of DOX-loaded G 3.5，G 4.0，PEG-G 4.0，F(xiàn)A-G 4.0 in MCF-7/ADR

圖2可以看出載藥大分子對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞抑制率的大小為:FA-G 4.0＞G 4.0＞PEG-G 4.0≈G 3.5＞DOX。根據(jù)公式:逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（Resistance Reversion Index RRI）=DOX組IC50/制劑組IC50。計(jì)算:FA-G 4.0對(duì)MCF-7/DOX的IC50為6.74 μg/mL，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為5.07。

2.1.3MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)載藥樹狀大分子的攝取細(xì)胞以1×106cells/mL種于12孔板，每孔2 mL細(xì)胞懸液。將DOX溶液和載藥大分子加入細(xì)胞懸液中，使藥物終濃度分別為6、12、18 μg/mL，每一濃度平行3孔，細(xì)胞孵育2小時(shí)后，去培養(yǎng)液，冷PBS洗3遍，200 μL胰酶消化細(xì)胞，1 mL的純水懸浮細(xì)胞。探頭超聲（400 w超聲8 min），10 000 rpm離心5 min，取上清液，在激發(fā)波長(zhǎng)為497 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為555 nm條件下，利用熒光分光亮度計(jì)測(cè)定DOX的濃度。結(jié)果見Fig.3。

Fig.3　The intracellular DOX amount in MCF-7/ADR after incubation with different concentrations of DOX formulations for 2h

3　討論

①載藥大分子對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞抑制率的大小為:FA-G 4.0＞G 4.0＞PEG-G 4.0≈G 3.5＞DOX。根據(jù)公式:逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（Resistance Reversion Index RRI）=DOX組IC50/制劑組IC50。計(jì)算:FA-G 4.0對(duì)MCF-7/DOX的IC50為6.74 μg/mL，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為5.07。研究表明陽(yáng)離子會(huì)擾亂細(xì)胞膜，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這種陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)所引起細(xì)胞毒性可能是帶負(fù)電的細(xì)胞膜和帶正電的載體間靜電相互作用的結(jié)果。表面帶正電的大分子對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性比帶負(fù)電的大分子低的多，表面帶負(fù)電的大分子濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí)也沒有溶血和細(xì)胞毒性。因此G4.0相對(duì)于G3.5、PEG-G 4.0，對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒作用更強(qiáng)。

②目前研究認(rèn)為PAMAM類高分子復(fù)合物的細(xì)胞攝取通過以下四種途徑發(fā)生：一是通過胞飲作用形成被膜包圍的囊泡；二是吸附性的細(xì)胞內(nèi)吞作用；三是受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用；四是吞噬作用。所以大分子制劑進(jìn)入細(xì)胞，是通過非P-gp依賴的途徑，避過了P-gp的外排作用，增加了細(xì)胞內(nèi)藥物的含量，一定程度上克服了MDR。用FA修飾PAMAM分子，形成FA-G 4.0，其進(jìn)入細(xì)胞的方式也發(fā)生了改變，是透過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，主動(dòng)被細(xì)胞攝取的，因此將特異性靶向細(xì)胞的配體與藥物載體結(jié)合，載體能特異性的被靶向細(xì)胞表面的受體識(shí)別并結(jié)合，避過P-gp的外排作用，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物的攝取。

綜上所述，PAMAM是一種具有良好克服腫瘤多藥耐藥性應(yīng)用前景的納米載藥系統(tǒng)。該實(shí)驗(yàn)對(duì)四種載藥大分子（G3.5/DOX，G 4.0/DOX，PEG-G 4.0/DOX，F(xiàn)A-G 4.0/DOX）對(duì)逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞多藥耐藥（MDR）的影響進(jìn)行研究，使納米載體在克服腫瘤多藥耐藥方面有了更大的突破。帶有不同電荷及配體的PAMAM有可能在體內(nèi)作用時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的多藥耐藥作用，其在體內(nèi)的研究將是我們研究的進(jìn)一步主題，可望在體內(nèi)試驗(yàn)中達(dá)到較好的抗MDR腫瘤治療效果。

［1］王海，許立峰，張超.載紫杉醇PLGA/F68納米粒逆轉(zhuǎn)多藥耐藥用于乳腺癌的治療［J］.生物醫(yī)學(xué)工程與臨床，2013，17（1）:17-21.

［2］Ting Chen，Changyuan Wang.Dasatinib reverses the multidrug resistance of breast cancer MCF-7 cells to doxorubicin by downregulaing P-gp expreesion via inhibiting the activation of ERK signaling pathway［J］.Biology&Therapy，2015，16（1）：106-114.

［3］周文菁，周望，等.阿霉素脂質(zhì)體對(duì)克服腫瘤多藥耐藥的細(xì)胞學(xué)體外評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（17）：1349-1352.

［4］吳俊，嚴(yán)新，等.阿霉素-姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯復(fù)方納米粒的研制及逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞多藥耐藥的研究［J］.中國(guó)生物工程雜志2013，33（5）：35-43.

［5］謝鑫，余敬謀，等.載阿霉素膠束對(duì)乳腺癌多藥耐藥MCF-7/ADR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（8）：597-600.

［6］李曉琳，胡海梅.聚酰胺-胺形樹狀大分子表面修飾的研究進(jìn)展［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30（2）:253-257.

Research on the Resistance of Four Polyamidoamine Dendrimers Formulation in Reversing Human Breast Carcinoma MCF-7/ADR Cells to Adriacin

SUN Dong-ni，NIU Lei
Pharmacology Teaching and Research Room，Anshan Health School，Anshan，Liaoning Province，114001 China

Objective To study the effect of dendrimers with different charges and ligands on the multidrug resistance of reversinghuman breast carcinoma MCF-7/ADR cells.Methods The cytotoxic effects of four drug loaded macromoleculars（G 3.5/DOX，G 4.0/DOX，PEG-G 4.0/DOX，F(xiàn)A-G 4.0/DOX）on the MCF-7/ADR cell were compared by taking adriacin as model drugs.Results The cellular poison formulated by four macromoleculars washigher than DOX solution，and FA-G 4.0（6.74 μg/mL）was the strongest，and its reversal index reached 5.07，after 2h incubation of macromolecular formulation，the adriacin concentration in MCF-7/ADR cell was FA-G 4.0/DOX＞G 4.0/DOX≈G 3.5/DOX＞PEG-G 4.0/DOX＞DOX solution.Conclusion Four macromolecular formulations can overcome the resistance of MCF/ADR cells to a certain degree，and there is no obvious difference in the effect of G 3.5/DOX，G 4.0/DOX，PEG-G 4.0/DOX on MDR，and the effect of FAG 4.0/DOX in overcoming MDR is the best.

Dendrimer；Human breast cancer adriacin cell；Multidrug resistance；P-gp；Folate-targeted

R96

A

1672-5654（2016）08（c）-0115-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.24.115

孫冬妮（1973-），女，滿族，遼寧鞍山人，碩士研究生，講師，主要從事于藥理方面的研究與教育工作。

（2016-05-26）