離子液體分散液-液微萃取-高效液相色譜法測定牛奶中己烯雌酚

戚 琦，黃 閔，謝海華（.贛南師范學院化學化工學院，江西 贛州 34000；.贛南醫學院第一附屬醫院，江西 贛州 34000）

離子液體分散液-液微萃取-高效液相色譜法測定牛奶中己烯雌酚

戚 琦1，黃 閔2，謝海華1
（1.贛南師范學院化學化工學院，江西 贛州 341000；2.贛南醫學院第一附屬醫院，江西 贛州 341000）

建立離子液體分散液-液微萃取與高效液相色譜-紫外檢測器相結合測定牛奶中己烯雌酚含量的方法。考察萃取溶劑、抗黏劑、pH值、離子強度及溫度對萃取效率的影響。結果表明，該法對樣品中己烯雌酚的萃取靈敏度高，檢出限為0.5 μg/L，相對標準偏差在2.80%～4.43%之間，平均回收率為93.7%～103.2%。該技術可以滿足牛奶中己烯雌酚含量的測定。

離子分散液-液微萃取；牛奶；己烯雌酚；高效液相色譜

己烯雌酚是一種人工合成的雌激素，可用于提高動物的生長速度，其一直作為促進劑用在牛、羊等畜禽飼料中[1]。現已證實它可在動物的肝臟、肌肉、脂肪等處殘留，是一種致癌物質，可誘發白血病、子宮癌等疾病[2-4]。由于己烯雌酚的濫用，動物性食品中己烯雌酚的殘留檢測引起了國內外的高度重視[5-7]。目前國內外報道用于己烯雌酚殘留檢測的方法很多。主要有氣相色譜法[8]、氣相色譜-質譜聯用法[9-10]、高效液相色譜法[11-12]、液相色譜-質譜聯用法[13-14]、電化學法[15-16]、免疫法[17-18]、蛋白質微陣列法[19]和分子印跡傳感器[20-21]等。傳統的樣品前處理技術存在操作繁瑣耗時，需要使用大量對人體和環境有毒、有害的有機溶劑等缺點。因此，發展省時高效，有機溶劑用量少的樣品前處理新技術，已成為分析化學研究的熱點之一。近年來，已發展了多種微萃取技術，例如：固相微萃取[11,22]、液相微萃取[23]、分散液相微萃取[24-25]等。本實驗利用綠色溶劑離子液體[Omim][PF6]作萃取溶劑，在超聲輔助的作用下，用曲拉通114為抗黏劑，建立了一種新型超聲輔助的離子液體冷誘導微萃取的樣品前處理技術，并成功應用于牛奶中己烯雌酚的分析檢測。該方法集采樣、萃取和濃縮于一體，操作簡單、快速、成本低、對環境友好且富集效率高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

[Bmim][PF6]、[Hmim][PF6]、[Omim][PF6]（純度均為99%） 上海成捷化學有限公司；己烯雌酚（純度為99%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；曲拉通100、曲拉通114（生物技術級） 上海美季生物技術有限公司；其他試劑均為分析純；所用水為超純水。

1.2 儀器與設備

1200系列高效液相色譜儀 美國Agilent公司；TG-16高速離心機 鞏義予華儀器設備有限公司；UP900超純水器 韓國Human Corporation公司；Delta 320 pH儀 美國Mettler-Toledo儀器有限公司；超聲清洗器 昆山超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：反相Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流動相：甲醇-水（0.043 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，65∶35，V/V）溶液；流速1 mL/min。

1.3.2 樣品處理

取2.5 g牛奶于25 mL離心管中，加5 mL磷酸鹽溶液（pH 5），混勻后離心（4 000 r/min，10 min）。上層清液轉入25 mL離心管，下層加5 mL磷酸鹽溶液（pH 5）。重復以上操作，合并上清液。

1.3.3 離子液體分散液-液微萃取

將35 μL[Omim][PF6]（萃取劑）和10 μL曲拉通114（抗黏劑）加入至1.3.2節中合并的上清液中，經振蕩后超聲10 min（55 ℃、頻率40 kHz、功率100 W）。乳化后的[Omim][PF6]溶液先置于冰水浴中冷卻5 min，而后離心5 min（5 000 r/min），移除上層溶液，用100 μL甲醇溶解沉積在離心管底部的[Omim][PF6]，用0.45 μm微孔濾膜過濾，用微量進樣器吸取10 μL進樣測定。

2 結果與分析

2.1 萃取溶劑的影響

由于[Bmim][PF6]在水中的溶解度比較大，不易形成乳化的兩相系統，本實驗考察了[Hmim][PF6]和[Omim] [PF6]的萃取能力，由圖1可知，使用[Omim][PF6]且用量為35 μL時萃取效率高。

圖1 離子液體的種類（A）和[Omim][PF ]的用量（B）對萃取效率的影響Fig.1 Effects of ionic liquid type (A) and [Omim][PF6] amount (B) on extraction efficiency

2.2 抗黏劑的影響

本實驗考察了2 種非離子型表面活性劑-曲拉通100、曲拉通114及其用量對萃取的影響，由圖2可知，曲拉通114作為抗黏劑效果較好，且用量為10 μL時萃取效率高。

圖2 抗黏劑的種類（A）和曲拉通114的用量（B）對萃取效率的影響Fig.2 Effect of Triton X type (A) and Triton X-114 (B) amount on extraction efficiency

2.3 pH值、離子強度及溫度的影響

如圖3所示，結果表明，pH值在3.0～8.0范圍內，只有在pH值為5.0時，萃取效率最高；當NaCl質量分數從0增加到10%，質量分數為6.0%時萃取效率較高；考察溫度從40 ℃增加到65 ℃，由圖3C可知，55 ℃時萃取效果最好。

圖3 pH值（A）、NaCl的質量分數（B）及溫度（C）對萃取效率的影響FFiigg..33 EEffffeeccttss ooff ppHH ((AA)),, iioonniicc ssttrreennggtthh ((BB)),, aanndd tteemmppeerraattuurree ((CC)) oonn extraction efficieennccyy

表1 回收率及精密度實驗結果（n=5）Table 1 Results of recovery and precision tests (n = 5)

3 結 論

2.4 方法的線性范圍、檢出限、精密度和加標回收率

在優化的萃取條件下考察超聲輔助的離子液體冷誘導微萃取技術對己烯雌酚萃取的線性范圍、檢出限（RSN=3）和精密度（n=10），結果見圖4，其線性范圍為5～300 μg/L，檢出限為0.5 μg/L。

圖4 萃取方法的標準工作曲線Fig.4 Standard curve established using the extraction method

在陰性牛奶樣品中分別添加0.2、0.4、0.8 μg/L 3 個質量濃度水平的己烯雌酚溶液，重復5 次，計算平均回收率和相對標準偏差，由表1可知，方法的平均回收率為93.7%～103.2%，相對標準偏差為2.80%～4.43%。本方法的精密度和重復性令人滿意。

本實驗建立了離子液體分散液-液微萃取的樣品前處理技術，采用高效液相-紫外檢測法測定牛奶中己烯雌酚含量的方法。考察了萃取溶劑、抗黏劑、pH值、離子強度及溫度對萃取效率的影響。結果表明，使用35 μL [Omim][PF6]、10 μL曲拉通114抗黏劑、pH 5.0、質量分數6.0% NaCl、溫度55 ℃時萃取效率較高。對該法進行精密度實驗，其平均回收率為93.7%～103.2%，相對標準偏差為2.80%～4.43%。說明該技術可以滿足牛奶中己烯雌酚含量的測定。[Omim][PF6]作為萃取溶劑，使該法具有操作簡單、環保、萃取效率高和靈敏度高等特點，有很好的應用前景。

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Determination of Diethylstilbestrol in Milk Using Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Followed by HPLC

QI Qi1, HUANG Min2, XIE Haihua1
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Gannan Normal University, Ganzhou 341000, China; 2. The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China)

A novel method for the determination of diethylstilbestrol in milk using dispersive liquid-liquid microextraction coupled to high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. Important parameters affecting extraction efficiency, such as extraction solvent type and volume, anti-sticking agent type and volume, pH, salt concentration and temperature, were discussed. Under the optimal conditions, the established method had high sensitivity, low detection limit and high stability for the analysis of diethylstilbestrol. Ultrasound-assisted ionic-liquid cold-induced aggregation dispersive liquid-liquid microextraction could be successfully used for the determination of diethylstilbestrol in milk.

dispersive liquid-liquid microextraction; milk; diethylstilbestrol; high performance liquid chromatography (HPLC)

10.7506/spkx1002-6630-201604036

TS207.3

A

1002-6630（2016）04-0202-04

戚琦, 黃閔, 謝海華. 離子液體分散液-液微萃取-高效液相色譜法測定牛奶中己烯雌酚[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 202-205.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604036. http://www.spkx.net.cn

QI Qi, HUANG Min, XIE Haihua. Determination of diethylstilbestrol in milk using dispersive liquid-liquid microextraction followed by HPLC[J]. Food Science, 2016, 37(4): 202-205. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604036. http://www.spkx.net.cn

2015-06-16

江西省教育廳科學技術研究項目（GJJ14654）

戚琦（1971—），女，副教授，碩士，研究方向為光譜學色譜學分析。E-mail：qiqichem@163.com