響應面試驗優化中性蛋白酶輔助提取青稞淀粉工藝

趙彥巧，朱志勇，李建穎，張麗君（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

響應面試驗優化中性蛋白酶輔助提取青稞淀粉工藝

趙彥巧，朱志勇，李建穎，張麗君
（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

采用中性蛋白酶輔助提取青稞淀粉，研究料液比、加酶量、酶解時間、酶解溫度和pH值對青稞淀粉中蛋白殘留量的影響，選擇加酶量、酶解時間、酶解溫度為影響因素進行響應面優化試驗。以淀粉蛋白殘留量和淀粉提取率為評價指標，確定最佳提取工藝條件。結果表明，加酶量、酶解溫度、酶解時間、加酶量與酶解溫度的交互作用及加酶量與酶解時間的交互作用對淀粉蛋白殘留量有極顯著影響，而對淀粉提取率無顯著影響。實驗范圍內得到的最佳提取工藝條件為加酶量140.79 U/g、酶解溫度45.01 ℃、酶解時間2.57 h，在此條件下青稞淀粉的提取率為60.36%，淀粉蛋白殘留量為1.31%。

青稞淀粉；中性蛋白酶；蛋白殘留；響應面

青稞是一種生長在我國西北、西南特別是西藏、青海一帶的極其重要的糧食作物，對青稞的研究主要集中在青稞葡聚糖[1-2]。青稞的淀粉平均含量為59.25%，遠高于其他谷類作物[3]。青稞淀粉理化性質非常獨特，有良好的工業應用潛力。對于淀粉的提取與分離，文獻報道的方法有堿法[4-6]和酶法[7-10]，堿法提取的淀粉一般糊化溫度較低，凝膠硬度較大，易于回生，溶解度和膨潤力較大，對淀粉顆粒有一定程度的破壞[11]；酶法提取的淀粉中一般蛋白質殘留量較大，結構緊密，糊化溫度和糊化黏度較高[12]。在酶法提取淀粉的過程中，采用堿性蛋白酶分離淀粉的報道居多，但是，堿性蛋白酶分離淀粉的過程中水解時間長（18～24 h），而且作用的pH值在堿性范圍內，會產生黃淀粉，并存在污水處理的問題[13]。也有關于中性蛋白酶進行淀粉提取的報道[14-15]，多用于玉米淀粉和小麥淀粉的提取，采用中性蛋白酶進行青稞淀粉提取鮮見報道。本實驗采用中性蛋白酶輔助提取青稞淀粉，通過單因素試驗研究料液比、加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH值等因素對淀粉蛋白殘留量的影響，選擇主要因素進行響應面優化試驗，探究中性蛋白酶輔助青稞粉提取淀粉的最佳工藝條件，為建立理想的青稞淀粉提取工藝路線及青稞的深加工和綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞粉來自云南香格里拉縣。

中性蛋白酶（酶活力≥10 000 U/g） 天津市諾奧科技發展有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市化學試劑一廠；無水碳酸鈉 天津市北方天醫化學試劑廠；三氯乙酸 上海伊卡生物技術有限公司；干酪素 杭州微生物試劑有限公司、L-酪氨酸、福林試劑 上海金穗生物科技有限公司；氫氧化鈉 天津市德恩化學試劑有限公司；牛血清蛋白 上海伯奧生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250 上海藍季科技發展有限公司；95%乙醇 天津市風船化學試劑科技有限公司；85%磷酸天津大學科威公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AUY-220電子分析天平 日本Shimadzu公司；WE-3水浴恒溫振蕩器、XMTD-204型數顯式電熱恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司；DGG-H-3型電熱鼓風干燥箱 天津市天宇實驗儀器有限公司；SK5210LHC超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司；PHS-3B型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；UV-7504型紫外-可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；DL-6000型低速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；3-18K低溫高速離心機 德國Sigma公司；高速萬能粉碎機 北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉提取工藝條件

酶解輔助淀粉提取工藝流程參考文獻[16-19]的淀粉提取工藝并加以改進，提取工藝如下：青稞粉過100 目篩，稱質量，按一定料液比加水浸泡制漿，加入中性蛋白酶，恒溫振蕩水浴酶解一定時間（加入三氯乙酸終止酶解）；將酶解液在5 000 r/min進行第1次離心，離心10 min，倒出上清液，刮去上層（暗黃色層），取下層（白色層）；將第1次離心得到的下層（白色層）加水制漿，過200 目篩后，淀粉漿在5 000 r/min進行第2次離心，離心10 min，倒出上清液，小心刮去上層（灰色層），收集下層產品；自然條件干燥24 h，得青稞淀粉。

1.3.2 響應面試驗優化提取工藝

根據Box-Behnken試驗設計原理[20-21]，選取加酶量、酶解時間及酶解溫度3 個因素，采用三因素三水平響應面試驗設計，響應面試驗的因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 淀粉含量的測定

依據GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》第一法酶水解法測定淀粉含量。

1.3.3.2 中性蛋白酶比活力的測定

依據GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》附錄B蛋白酶活力的測定-福林法測定中性蛋白酶的比活力。

1.3.3.3 淀粉中蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍法測定淀粉中蛋白質的含量[22]。

1.3.3.4 淀粉提取率的計算

1.3.3.5 淀粉中蛋白殘留量的計算

2 結果與分析

2.1 青稞原料中淀粉含量

經測定，本實驗所選用的青稞原料的平均淀粉含量為56.77%，與文獻[1]報道的淀粉平均含量59.25%相當。

2.2 中性蛋白酶的比活力

經測定，本實驗所選用中性蛋白酶的比活力為8 000 U/g，與中性蛋白酶生產廠家所標示的比活力基本一致，酶活力較高且穩定。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 料液比對蛋白殘留量的影響

圖1 料液比對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on the residual protein content of starch

在中性蛋白酶添加量100 U/g、提取溫度45 ℃、提取時間1.5 h的條件下，分別按照料液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL）進行青稞淀粉的提取，探討料液比對其蛋白殘留量的影響，由圖1可以看出，當溶劑用量過小時，淀粉蛋白殘留量較高，原因可能是溶劑用量過小時，酶促反應體系過小，不利于酶促反應的進行；隨溶劑用量的增加，酶與底物充分接觸，酶解完全，淀粉蛋白殘留量逐漸降低，使淀粉粒子最大限度游離出來[23-24]。在料液比1∶4之后，蛋白殘留量下降速率變緩，考慮到廢液處理和環境保護的問題，故在響應面優化試驗中不再考慮料液比對蛋白殘留量的影響，選擇料液比1∶4進行后續試驗。

2.3.2 加酶量對蛋白殘留量的影響

圖2 加酶量對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on the residual protein content of starch

在料液比1∶4（g/mL）、提取溫度45 ℃、提取時間1.5 h的條件下，分別按照加酶量為80、100、120、140、160 U/g進行青稞淀粉的提取，探討加酶量對其蛋白殘留量的影響，由圖2可以看出，加酶量對淀粉蛋白殘留量的影響較為顯著，隨著加酶量的增加，淀粉蛋白殘留量下降速率呈現先增大后減小的趨勢。當加酶量較少時，酶質量濃度大大低于飽和質量濃度，由酶促反應動力學可知，加酶量成為酶促反應的主要限制因素，此時酶質量濃度與反應速率呈正比關系[25]，因此蛋白殘留量也隨著酶質量濃度的增加而降低。當加酶量為120 U/g時，酶質量濃度達到飽和，所以蛋白殘留量降低速率減緩，考慮到實際生產的成本問題，加酶量不宜過高，且當考察加酶量與其他因素的交互作用時，較低水平的加酶量也可能產生良好的催化效果，故選取120、140、160 U/g 3 個水平進行響應面優化試驗。

2.3.3 酶解時間對蛋白殘留量的影響

圖3 酶解時間對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on the residual protein content of starch

在料液比1∶4（g/mL）、中性蛋白酶添加量100 U/g、酶解溫度45 ℃的條件下，分別酶解1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，探討酶解時間對其蛋白殘留量的影響，由圖3可以看出，酶解時間對淀粉蛋白殘留量的影響較為顯著，隨酶解時間的延長，淀粉蛋白殘留量降低速率呈現先增大后減小的總趨勢。在酶促反應初期，酶活性及反應速率都比較高，隨酶解時間的延長，酶促反應不斷進行，所以淀粉蛋白殘留量不斷減少。但當酶解時間超過3 h后，酶促反應基本進行完全，與文獻[26]報道的中性蛋白酶酶解時間基本相同。考慮到時間成本，選取2.0、2.5、3.0 h 3 個水平進行響應面優化試驗，探究酶解時間及其與其他因素的交互作用對淀粉蛋白殘留量的影響。

2.3.4 酶解溫度對蛋白殘留量的影響

圖4 酶解溫度對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperatures on the residual protein content of starch

在料液比1∶4（g/mL）、中性蛋白酶添加量100 U/g、酶解時間1.5 h的條件下，控制酶解溫度分別為35、40、45、50、55 ℃，探討酶解溫度對蛋白殘留量的影響，由圖4可以看出，酶解溫度對淀粉蛋白殘留量的影響較為顯著，隨酶解溫度的升高，蛋白殘留量先減小后增大，最小值出現在酶解溫度為50 ℃時。溫度是影響酶活性的最重要因素之一[27-28]。蛋白酶具有特定的空間結構，溫度較低時，不能使結構充分的舒展，活性也不能充分發揮，升溫有利于加快反應速率，而當溫度過高時，蛋白質變性而導致蛋白酶結構破壞，從而喪失或部分喪失活性；此外，較高的溫度也可能使產生的淀粉糊化，黏度增大，影響蛋白酶的作用效果。考慮到經濟成本，選取40、45、50 ℃ 3 個水平進行響應面優化試驗。

2.3.5 pH值對蛋白殘留量的影響

圖5 pH值對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.5 Effect of pH on the residual protein content of starch

在料液比1∶4（g/mL）、中性蛋白酶添加量100 U/g、酶解溫度45 ℃、酶解時間1.5 h的條件下，分別調節pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，探討pH值對淀粉蛋白殘留量的影響，由圖5可以看出，pH值升高，淀粉蛋白殘留量先減小后增大，在pH值為7時，淀粉蛋白殘留量最小，與文獻[29]報道的中性蛋白酶的最適pH值相當。考慮到調節pH值之后，還需要進行中和，后續過程中會涉及廢水處理和脫鹽處理，工序復雜，而且不利于環境保護，故選擇不調節pH值，此時pH值為6.8。

2.4 響應面優化提取工藝結果

2.4.1 響應面試驗結果

以蛋白殘留量（R1）和淀粉提取率（R2）為考察指標，響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

經回歸擬合后，各試驗因素對響應值蛋白殘留量的影響可用如下函數表示：

R1=111.908 75－0.729 21A－9.166 67B－2.011 00C＋0.022 750AB＋2.025 00×10－3AC－9.000 00×10－3BC＋2.030 21×10－3A2＋1.148 33B2＋0.018 883C2

運用Design-Expert 8.0.6軟件對15 個試驗點的響應值進行回歸分析，結果見表3。

表3 蛋白殘留量回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表3可知，此模型的F值81.37，P＜0.000 1，回歸模型高度顯著。模型的一次項A、B、C極顯著，二次項A2、B2、C2極顯著，交互項AB、AC極顯著。回歸模型的決定系數R2=0.993 2，調整后的回歸模型決定系數=0.981 0，說明模型擬合程度好。失擬項P=0.050 8，不顯著，說明本試驗無其他顯著因素的影響，試驗條件合適。各因素對淀粉蛋白殘留量的影響次序是：B（酶解時間）＞A（加酶量）＞C（酶解溫度）＞AB＞AC＞BC，其中加酶量、酶解時間、酶解溫度、加酶量與酶解時間的交互作用及加酶量與酶解溫度的交互作用對蛋白殘留量有極顯著影響。

經回歸擬合后發現，各試驗因素對淀粉提取率的影響并不顯著，故在此不再討論。

2.4.2 因素間交互作用的響應面

為了進一步研究相關因素之間的交互作用，通過Design-Expert繪制響應面圖進行直觀分析，對蛋白殘留量有交互影響的響應面分析立體曲面見圖6。

圖6 各因素交互作用對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.6 Effect of interaction between various factors on the residual protein content of starch

由圖6a可以看出，加酶量與酶解時間之間存在明顯的交互作用，表現為等高線呈橢圓形。中性蛋白酶的添加量在130～150 U/g之間時，隨著酶解時間的延長，淀粉蛋白殘留量減少。當中性蛋白酶的添加量大于150 U/g時，淀粉的蛋白殘留量又隨著酶解時間的延長而升高。由圖6b可以看出，加酶量與酶解溫度之間存在明顯的交互作用，表現為等高線呈橢圓形。中性蛋白酶的添加量在130～150 U/g之間時，隨著酶解溫度的升高，淀粉蛋白殘留量減少。當中性蛋白酶的添加量大于150 U/g時，淀粉的蛋白殘留量又隨著酶解溫度的升高而增大。由圖6c可以看出，酶解時間和酶解溫度之間無明顯交互作用。

按照響應面最佳條件，即加酶量140.79 U/g，在45.01 ℃條件下酶解2.57 h，對中性蛋白酶輔助青稞淀粉的提取進行3 次平行驗證實驗。驗證實驗結果表明在上述最佳條件下淀粉的平均提取率為60.36%，淀粉蛋白殘留量平均值為1.31%，而預測的最小值為1.27%，兩者吻合較好。

3 結 論

本實驗采用中性蛋白酶輔助從青稞粉中提取淀粉，在單因素試驗的基礎上選擇加酶量、酶解時間、酶解溫度3 個主要影響因素進行響應面優化試驗，探究中性蛋白酶輔助青稞粉提取淀粉的最佳工藝條件，降低淀粉蛋白殘留量，得出如下主要結論：料液比對淀粉蛋白殘留量的影響并不顯著，但過低的溶劑用量會使蛋白殘留量升高，考慮到廢水處理及節水節能，較為理想的料液比為1∶4；各因素對淀粉提取率的影響并不顯著；各因素對淀粉蛋白殘留量的影響次序是：B（酶解時間）＞A（加酶量）＞C（酶解溫度）＞AB＞AC＞BC，其中加酶量、酶解時間、酶解溫度、加酶量與酶解時間的交互作用及加酶量與酶解溫度的交互作用對蛋白殘留量有極顯著影響。

根據響應面優化試驗結果，得到最佳提取工藝條件：中性蛋白酶量140.79 U/g，在45.01 ℃條件下酶解2.57 h。此時青稞淀粉的提取率為60.36%，淀粉蛋白殘留量為1.31%。

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Optimization of Neutral Protease-Assisted Extraction of Highland Barley Starch

ZHAO Yanqiao, ZHU Zhiyong, LI Jianying, ZHANG Lijun
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

The neutral protease-assisted extraction of highland barley starch was optimized using response surface methodology. The effects of several operating parameters, namely solid to liquid ratio, enzyme dosage, hydrolysis time, temperature and pH, on the residual protein content of highland barley starch were studied. Three main factors including enzyme dosage, hydrolysis time and temperature were chosen to design response surface experiments using residual protein content and starch yield as the responses. The results showed that the three selected factors as well as the interaction between enzyme dosage and either hydrolysis time or temperature all had significant effects on residual protein content, but had no significant effects on starch yield. The optimal extraction conditions in the selected experimental ranges were determined as follows: enzyme dosage, 140.79 U/g; temperature, 45.01 ℃; and hydrolysis time, 2.57 h, leading to a starch yield of 60.36% and a residual protein content of 1.31%.

highland barley starch; neutral protease; residual protein; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201604006

TS235.1

A

1002-6630（2016）04-0031-06

趙彥巧, 朱志勇, 李建穎, 等. 響應面試驗優化中性蛋白酶輔助提取青稞淀粉工藝[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 31-36. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604006. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Yanqiao, ZHU Zhiyong, LI Jianying, et al. Optimization of neutral protease-assisted extraction of highland barley starch[J]. Food Science, 2016, 37(4): 31-36. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604006. http://www.spkx.net.cn

2015-07-09

天津市高校科技發展基金項目（140023）；天津市高等學校“十二五”綜合投資人才培養項目（507-125RCPY0315）；

天津市教育科學“十二五”規劃重點研究課題（HE3024）；天津市科學技術普及項目（13KPXM01SY008）；

天津市科技型中小企業技術創新資金項目（13ZXCXSY08400）

趙彥巧（1979—），女，副教授，博士，研究方向為天然產物的提取與分離。E-mail：yqzhao@tjcu.edu.cn