殼聚糖及其水溶性衍生物對小鼠免疫功能的影響

王志華，江陽陽，余曉華，顏永斌*，覃彩芹

殼聚糖及其水溶性衍生物對小鼠免疫功能的影響

王志華1，江陽陽1，余曉華1，顏永斌2,*，覃彩芹2

（1.湖北工程學院 特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000；2.湖北工程學院 生物質資源化學與環境生物技術湖北省重點實驗室，湖北 孝 感 432000）

給小鼠喂食殼聚糖（chitosan，CS）、羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）、殼聚糖季銨鹽（quaternary ammonium salt of chitosan，HACC）和羥丙基殼聚糖（hydroxypropyl chitosan，HPCS）30 d后，測定其免疫器官指數、碳粒廓清速率、遲發型變態反應、血清溶血素含量（半數溶血值HC50）。結果表明：攝食CS及其水溶性衍生物的小鼠以上指標均高于對照組；除胸腺指數和雙耳質量差值外，HACC組小鼠其他各項免疫指標與對照組相比均呈顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）；同樣，除胸腺指數外，HPCS組小鼠其他各項免疫指標均顯著或極顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01）；CMCS組小鼠的吞噬指數（K）和半數溶血值（HC50）與對照組相比均呈顯著差異（P＜0.05）；殼聚糖及其3 種水溶性衍生物都能夠增強小鼠免疫功能，增強效果排序為HPCS＞HACC＞CMCS＞CS，這可能與引入的化學基團不同有關。

殼聚糖；水溶性衍生物；免疫功能

殼聚糖（chitosan，CS）是天然多糖中唯一的陽離子聚合多糖，主要來源于節肢動物（蝦、蟹）、軟體動物的外殼以及真菌的細胞壁，是一種豐富的可再生資源[1-2]。因其具有一些獨特的生物活性，如抗微生物、抗氧化、增 強免 疫功能、調節血脂水平、抑制腫瘤等，CS被廣泛應用于生物醫藥、食品工程等領域[3-6]。自1983年美國食品和藥物監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準CS作為食品添加劑以來，CS已被廣泛用于食品工業中，多用于制成保健食品或作為食品添加劑和果汁保鮮劑[7-9]。據文獻報道，CS對小鼠非特異性免疫和特異免疫有明顯 的促進作用，可活化自然殺傷（nat ural killer，NK）細胞以及調節殺傷性T細胞的免疫活性，增強機體免疫力[10-11]。但CS不溶于水，使其應用受到了很大限制。CS經過化學修飾或降解為低聚物，其水溶性提高的同時，生物學活性也會發生改變。研究表明，水溶性的低分子質量CS能增強正常小鼠的免疫功能[12]；羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）通過增強小鼠免疫力抑制S180腫瘤細胞生長[13]；殼聚糖季銨鹽（quaternary ammonium salt of chitosan，HACC）作為免疫佐劑可增強戊型肝炎病毒疫苗的免疫效果[14]。水溶性羥丙基殼聚糖（hydroxypropyl c hitosan，HPCS）是CS的羥丙基化衍生物，對其應用和生物活性已開展了大量研究，如抗菌活性等[15]，但有關其免疫活性尚未見文獻報道。本研究主要通過給小鼠攝食CS及其3 種水溶性衍生物，比較分析HPCS與CMCS、HACC對小鼠體內免疫功能的影響，初步探討CS水溶性衍生物中不同功能基團對小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

CS（Mw2.48×105D、脫乙酰度92%） 浙江金殼生物化學有限公司；CMCS、HACC和HPCS由本實驗室在堿性條件下將CS與氯乙酸、環氧丙烷、2,3-環氧丙基三甲基氯化銨進行化學反應制備[16-18]，其取代度分別為0. 81、0.72和0.79，重均分子質量（Mw）分別為1.42×105、1.71×105、1.56×105D。

4 周齡清潔級雌性昆明小鼠，體質量18～22 g，小鼠及其食用的基礎飼料均由湖北省實驗動物中心提供。

二硝基氟苯（dinitrofluorobenzene，DNFB）為優級純試劑，其他試劑均為 分析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

Cary 60紫外-可見分光光度計 美國Agilent公司；TGL-16C臺式離心機 上海安亭儀器廠；Impact 410 FTIR紅外光譜儀 美國尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

將50 只健康的雌性昆明小鼠適應飼養1 周，隨機分為5 組：對照組小鼠喂食基礎飼料，其他4 組小鼠分別喂食含質量分數1.5% CS、HACC、CMCS和HPCS的飼料。持續喂養期間自由飲水，每周稱體質量，第31天將小鼠頸椎脫臼處死，取 出肝臟、脾臟和胸腺稱質量。

1.3.2 CS及其水溶性衍生物的紅外光譜掃描

取少量的CS及其水溶性衍生物樣品，用紅外光譜儀在4 000～400 cm?1波數范圍內掃描，得到其紅外光譜圖。

1.3.3 碳粒廓清實驗

將含CS、CMCS、HACC和HPCS的不同飼料和基礎飼料持續喂養小鼠30 d后，尾靜脈注射1∶4（V/V）稀釋的印度墨汁0.1 mL/10 g（以體質量計，下同），注入后立即計時，并分別于2 min和10 min用抗凝過的平口毛細管從小鼠眼眶內眥靜脈叢取血0.025 mL，加入到盛有2 mL 0.1%碳酸鈉溶液的管中，以0.1%碳酸鈉溶液為空白，于600 nm波長處測定吸光度（A600nm）。

1.3.4 小鼠血清溶血素抗體水平測定

將含CS、CMCS、HACC和HPCS的不同飼料和基礎飼料持續喂養小鼠30 d。在實驗結束3 d前，給小鼠腹腔注射0.2 mL 10%的綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC），3 d后摘眼球取血，分離血清。將每組小鼠的血清混合于試管中，用生理鹽水1∶1稀釋。取稀釋血清1 mL置于冰浴中，依次加入10% SRBC 0.25 mL、生理鹽水1∶10（V/V）稀釋的豚鼠血清1 mL，37 ℃水浴中孵育30 min，冰水浴終止反應，2 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加都氏液3 mL混勻，10 min后于540 nm波長處測定吸光度，對照組以1 mL生理鹽水代替樣品血清。另設半數溶血管，取10% SRBC 0.125 mL加都氏液至4 mL混勻，10 min后于540 nm波長處測定吸光度，以半數溶血值（HC50）判斷血清溶血素抗體水平。

1.3.5 遲發型變態反應

將含CS、CMCS、HACC和HPCS的不同飼料和基礎飼料持續喂養小鼠30 d。在實驗結束6 d前，稱取DNFB 50 mg，置于清潔干燥小瓶中，將預先配好的5 mL丙酮-麻油（1∶1，V/V）溶液倒入小瓶，混勻后，取DNFB溶液50 μL均勻涂抹在用硫化鋇脫毛的4 個CS及其水溶性衍生物組和對照組小鼠腹部皮膚上（約3 cm×3 cm）致敏。5 d后，用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊。攻擊后24 h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左、右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片，稱質量。

1.4 數據統計分析

所有數據以±s示，均采用SPSS 19.0統計學軟件中的單因素方差分析（one-way analysis of variance，oneway ANOVA）進行數據處理，比較實驗組與對照組間的差異。

2 結果與分析

2.1 CS及其水溶性衍生物的結構分析

CS及其水溶性衍生物的紅外光譜如圖1所示。與CS相比，CMCS在1 415 cm?1處出現—COOH對稱伸縮振動吸收峰，而—COOH非對稱伸縮振動吸收峰（1 720～1 550 cm?1）與乙酰氨基的特征吸收峰（1 645 cm?1）疊加，在1 580 cm?1處形成一個新的強吸收峰。HACC在1 482 cm?1處出現季銨基團的C—H彎曲振動的新吸收峰。HPCS在1 428 cm?1處出現一個較強的新吸收峰、在2 976 cm?1處出現一個新的吸收峰，這兩處吸收峰分別歸因于—CH3的C—H伸縮振動和不對稱變形，表明CS分子上連接有羥丙基基團。

圖1 CS及其水溶性衍生物的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of chitosan and its derivatives

2.2 CS及其水溶性衍生物對小鼠體質量的影響

4 周齡小鼠攝食含質量分數1.5% CS、CMCS、HACC和HPCS的飼料，在實驗期內活動、生長正常。CS及其水溶性衍生物對小鼠體質量的影響如表1所示。各組小鼠初始體質量相近，實驗結束時，CS及其水溶性衍生物組小鼠體質量比對照組小鼠體質量略高，但無統計學意義。

表1 各組小鼠體質量的變化（x±s , n＝10）Table 1 Body weight changes of mice (x±s , n= 10)

2.3 CS及其水溶性衍生物對小鼠免疫器官指數的影響

攝食CS及其水溶性衍生物30 d后，各組小鼠的免疫器官指數如表2所示。免疫器官質量是反映機體免疫功能重要而直觀的指標，CS及其水溶性衍生物組小鼠脾臟指數和胸腺指數均有所增加，尤其是HACC組和HPCS組小鼠 的脾臟指數與對照組相比差異顯著（P＜0.05），以上結果表明HACC和HPCS促進小鼠免疫功能的效果比CMCS、CS好。

表2 小鼠免疫器官指數（x± s ＝10）Table 2 Immune organ index changes of mice (x± s , = 10)

2.4 CS及其水溶性衍生物對小鼠單核巨噬細 胞吞噬功能的影響

表3 小鼠碳粒廓清速率 (x±s ,n = 10)Table 3 Effect of chitosan and its derivatives on the carbon clearance rate in mice (x±s ,n = 10)

表3顯示了CS及其水溶性衍生物對小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響，CS及其水溶性衍生物組小鼠的吞噬指數（K）和吞噬系數（α）均高于對照組，其中HAC C組和HPCS組與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），C MCS組小鼠的吞噬指數與對照組相比差異顯著（P＜0.05），以上結果表明CS衍生物能夠促進小鼠巨噬細胞碳粒廓清功能。

2.5 CS及其水溶性衍生物對小鼠遲發型變態反應的影響

圖2 CS及其水溶性衍生物對小鼠遲發型變態反應的影響Fig.2 Effect of chitosan and its derivatives on mouse delayed type hypersensitivity (DTH)

CS及其水溶性衍生物對小鼠遲發型變態反應的影響如圖2所示。DNFB致敏小鼠后，CS及其水溶性衍生物組小鼠的雙耳質量差值均高于對照組，HPCS組與對照組相比差異顯著（P＜0.05），其他各組與對照組相比差異不明顯（P＞0.05），以上結果表明HPCS能夠促進小鼠細胞免疫功能的恢復。

2.6 CS及其水溶性衍生物對小鼠血清溶血素水平的影響

圖3 CS及其水溶性衍生物對小鼠血清溶血素的HHCC5500的影響Fig.3 Effect of chitosan and its derivatives on the content of serum hemolysin in mice

SRBC免疫小鼠后，B淋巴細胞受抗原刺激，分化為漿細胞，漿細胞產生抗體，其含量反映了小鼠特異性體液免疫的功能。由圖3可知，CS及其水溶性衍生物均可提高小鼠血清溶血素的HC50，與對照組比較，HACC、HPCS和CMCS均能顯著或極顯著提高小鼠血清溶血素含量（P＜0.05或P＜0.01），以上結果表明攝食CS及其水溶性衍生物有利于增強小鼠特異性體液免疫功能。

3 討 論

免疫系統的功能是消除病原微生物，清除損傷、衰老及死亡的自身細胞，監視發生突變的細胞，維持機體內環境的穩定。現代社會中人們由于各種壓力和飲食結構不合理，導致體內環境酸醎不平衡，免疫系統功能紊亂，誘發頑固性疾病的發生。CS天然無毒，其氨基可以結合H+、提高HCO3?濃度，使體液pH值傾向弱堿性，激活巨噬細胞，為淋巴細胞（T細胞和B細胞）的激活提供適宜的環 境，提高機體免疫力，作為增強機 體免 疫功能的保健食品和藥物開發有良好的發展前景。

本研究將CS通過化學修飾制備成水溶性的CMCS、HACC和HPCS，經元素分析，CMCS、HACC和HPCS的取代度相近，依次為0.81、0.72和0.79。小鼠攝食4 種CS及其水溶性衍生物后，通過 對其免疫器官指數和碳粒廓清指數、血清溶血素含量和遲發型變態反應等免疫指標分析[19-21]，發現4 種CS及其水溶性衍生物均能增強小鼠的免疫功能。但四者相比較，HPCS效果最好，其次是HACC，CMCS次之，CS效果較差，這暗示CS及其水溶性衍生物的免疫效果可能與引入的化學基團有關。CS不溶于水，這嚴重影響了其生物活性。從結構特征看，CS羥丙基化后，不僅其水溶性升高，同時易被消化道壁吸收降解，而且還使羥基的活性增加，分布到各組織細胞中，促進其與巨噬細胞和樹突狀細胞表面的膜受體（TLR4和甘露糖受體）結合[22]；經季銨基團修飾的CS，分子上正電荷密度增加，增強了其與帶負電荷的淋巴細胞 的親和性。兩者通過不同方式活化巨噬細胞和樹突細胞，尤其是樹突細胞。活化的樹突細胞會釋放細胞因子、使膜主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）MHCⅡ分子表達量增加、T細胞活化；活化的T細胞釋放細胞因子白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-10、腫瘤壞死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ），進一步活化其他免疫細胞，產生抗體和具有免疫活性的NK細胞、粒細胞等，增強機體的免疫力[23-26]；CMCS結構中含有—NH2和—COOH，既帶有正電荷又帶有負電荷，削弱了其改變體液環境pH值的能力以及與帶負電荷巨噬細胞的親和性，因此其增強小鼠免疫功能的活性弱于HACC。從結構上推測化學修飾基團在免疫調節過程發揮著重要作用，CS及其水溶性衍生物調節免疫活性的機理還有待進一步深入研究。

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Effect of Chitosan and Its Water-Soluble Derivatives on Immune Function in Mice

WANG Zhihua1, JIANG Yangyang1, YU Xiaohua1, YAN Yongbin2,*, QIN Caiqin2
(1. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, China; 2. Hubei Key Laboratory of Biomass-Resource Chemistry and Environmental Biotechnology, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, Chin a)

The immune organ index, carbon clearance rate, delayed type hypersensitivity, and serum hemolysin (HC50) in mice were compared and analyzed after the administration of chitosan (CS), carboxymethyl chitosan (CMCS), quaternary ammonium salt of chitosan (HACC) and hydroxypropyl chitosan (HPCS) for 30 days. The values of all investigated parameters were higher in mice administered with CS or its water-soluble derivatives compared with the control group. A significant difference (P ＜ 0.05) or extremely significant difference (P ＜ 0.01) in all immune inde xes except for thymus index and binaural weight difference was found for the HACC an d HPCS groups compared with the control group. Comparing the CMCS group with the control group, a significant difference in carbon clearance rate and the content of serum hemolysin (P ＜ 0.05) was observed. These results indicated that the administration of chitosan and its water-soluble derivatives could enhance the immune function of mice in the decreasing order of HPCS ＞ HACC ＞ CMCS ＞ CS. This may be associated with the introduction of chemical groups.

chitosan; water-soluble derivatives; immune function

10.7506/spkx1002-6630-201601035

O6 36.1

A

1002-6630（2016）01-0198-05

王志華, 江陽陽, 余曉華, 等. 殼聚糖及其水溶性衍生物對小鼠免疫功 能的影響[J]. 食品科學, 2016, 37(1): 198-202.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601035. http://www.spkx.net.cn

WANG Zhihua, JIANG Yangyang, YU Xiaohua, et al. Effect of chitosan and its water-soluble derivatives on immune function in mice[J]. Food Science, 2016, 37(1): 198-202. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201 601 035. ht tp://www.spkx.net.cn

2015-03-15

湖北省教育廳科學技術研究項目（B2015037）；國家自然科學基金面上項目（31371750）

王志華（1973—），女，副教授，碩士，研究方向為動物生理。E-mail：wangzhihuay@126.com

*通信作者：顏永斌（1975—），男，副教授，博士，研究方向為天然高分子的轉化與利用。E-mail：yybyan@163.com