低溫環(huán)境對球等鞭金藻3011抗氧化系統(tǒng)和二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響

王 婷，趙 培，王雪青*

低溫環(huán)境對球等鞭金藻3011抗氧化系統(tǒng)和二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響

王 婷，趙 培，王雪青*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

以球等鞭金藻（Isochrysis galbana）3011為對象，通過研究降低培養(yǎng)溫度后其超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性以及還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量的變化，以闡明低溫環(huán)境對球等鞭金藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)和DHA含量的影響。用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光染色法測定低溫環(huán)境對球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響；并采用氣相色譜法檢測球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)DHA含量。結(jié)果表明：在21、18、15 ℃低溫環(huán)境處理下，球等鞭金藻細(xì)胞SOD、CAT和POD活性均隨培養(yǎng)時(shí)間延長而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；溫度越低，峰值出現(xiàn)越早，且峰值越大，峰后酶活性下降越快；GSH含量的變化趨勢與上述酶活性的變化相似，MDA含量則持續(xù)增加；ROS水平隨著溫度的降低而呈現(xiàn)出較為復(fù)雜的變化，15 ℃和18 ℃誘導(dǎo)16 h出現(xiàn)ROS水平爆發(fā)，20 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為（14.11±0.11）%和（14.74±0.58）%（P＜0.05）；經(jīng)18 ℃低溫誘導(dǎo)24 h后，球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)DHA含量為0.105 mg/g，比對照組高0.06 mg/g。因此，低溫環(huán)境可以作為提高代謝物產(chǎn)量的誘導(dǎo)子，使球等鞭金藻細(xì)胞產(chǎn)生主動防御反應(yīng)，引起清除活性氧相關(guān)的酶活性的升高，同時(shí)也提高了DHA產(chǎn)量。

球等鞭金藻3011；抗氧化；低溫；活性氧；二十二碳六烯酸

微藻是生活在海洋或者陸地中的微小生物，是最主要的初級生產(chǎn)者，對于穩(wěn)定海洋生態(tài)系統(tǒng)有著非常重要的作用。一些環(huán)境因子發(fā)生變化，如溫度除了能改變微藻的生長和發(fā)育速率、調(diào)控某些酶的活性之外，還會影響細(xì)胞的營養(yǎng)組成、營養(yǎng)素的利用率等，以達(dá)到主動適應(yīng)環(huán)境改變的目的[1]。有研究報(bào)道，低溫可以改變機(jī)體內(nèi)與抗氧化防御系統(tǒng)密切相關(guān)的酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基含量增加[2-4]。在植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)過程中，如青蒿、長春細(xì)胞，一定量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可充當(dāng)環(huán)境刺激信號的二級信使，通過細(xì)胞信號的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)環(huán)境因子對細(xì)胞代謝產(chǎn)物含量和組成的調(diào)控[5-8]。

球等鞭金藻屬于金藻門，普林藻綱，等鞭藻目，等鞭藻科。由于其個(gè)體小、無細(xì)胞壁、易消化、富含多糖及多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等代謝產(chǎn)物，是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的開口餌料，同時(shí)也是生產(chǎn)DHA的潛力藻種。有研究顯示低溫可以促進(jìn)多不飽和脂肪酸的形成[9]，因此通過低溫環(huán)境刺激來提高細(xì)胞內(nèi)DHA含量是其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵步驟。然而關(guān)于球等鞭金藻受到低溫環(huán)境的刺激時(shí)，其與ROS密切相關(guān)的酶的變化以及一些次生代謝產(chǎn)物的積累尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以適當(dāng)?shù)牡蜏丨h(huán)境作為刺激因子，研究其對球等鞭金藻的抗氧化系統(tǒng)和DHA含量的影響，為提高球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)DHA含量和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)DHA提供可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

球等鞭金藻（Isochrysis galbana）3011由中國海洋大學(xué)水產(chǎn)系實(shí)驗(yàn)室提供。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化物酶（peroxidase，POD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（dichlorodihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA）、冰醋酸、磷酸鹽緩沖液、DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國BD公司；TI-U倒置式熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 球等鞭金藻的培養(yǎng)

采用f/2培養(yǎng)基對球等鞭金藻進(jìn)行培養(yǎng)，按體積分?jǐn)?shù)10%接種，培養(yǎng)溫度24～26 ℃，明/暗周期為14 h/10 h，光照度為4 500 lx，于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3.2 抗氧化指標(biāo)的測定

取培養(yǎng)至對數(shù)后期的球等鞭金藻，經(jīng)分瓶后分別在24、21、18、15 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h（每組3 個(gè)平行，其中24 ℃作為對照組），每6 h定時(shí)測定球等鞭金藻細(xì)胞的SOD、POD、CAT活力以及GSH、MDA含量。

1.3.2.1 粗酶液的提取及蛋白質(zhì)量濃度的測定

取培養(yǎng)11 d至對數(shù)末期的球等鞭金藻液40 mL，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，收獲球等鞭金藻細(xì)胞。用4 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）重懸細(xì)胞，冰浴條件下超聲破碎30 次（功率400 W、時(shí)間3 s、間隔3 s），4 ℃靜置1 h，12 000 r/min離心20 min，上清液即為酶粗提液。取粗酶液1 mL并加入考馬斯亮藍(lán)溶液3 mL，在595 nm波長處測定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量（mg/mL）為縱坐標(biāo)，根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法測定牛血清白蛋白所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.105 6x－0.034 4（R2=0.995），計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.2 SOD活力測定

黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶催化下產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2－?），當(dāng)反應(yīng)體系中有SOD時(shí)，O2－?可被氧化生成H2O2，其可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，通過測定550 nm波長處吸光度的變化即可得出SOD活力，設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法進(jìn)行。酶活力單位（U）定義為在上述反應(yīng)條件下，抑制1 mL反應(yīng)液中O2－?氧化后將氧化羥胺轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}，并與顯色劑反應(yīng)后形成紫紅色絡(luò)合物所需要的酶量。按照公式（1）計(jì)算SOD活力。

式中：0.5為說明書所提供的參數(shù)；對照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測樣。

1.3.2.3 POD活力測定

POD催化過氧化氫和愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生醌類化合物，此化合物進(jìn)一步縮合成有顏色的化合物，通過測定420 nm波長處吸光度的變化即可得出POD活力，設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法進(jìn)行。酶活力單位（U）定義為在上述反應(yīng)條件下，在30 min內(nèi)以1 mL反應(yīng)液中愈創(chuàng)木酚為底物催化過氧化氫形成醌類化合物進(jìn)一步縮合成有色化合物所需要的酶量。按照公式（2）計(jì)算POD活力。

式中：12、1 000為說明書提供參數(shù)；1為比色光徑系數(shù)；30為反應(yīng)時(shí)間/min；對照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測樣。

1.3.2.4 CAT活力測定

CAT分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速終止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種黃色的絡(luò)合物，通過測定405 nm波長處吸光度的變化即可得出CAT活力，設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法進(jìn)行。酶活力單位（U）定義為在上述反應(yīng)條件下，在60 min內(nèi)分解1 mL反應(yīng)液中H2O2所需要的酶量。按照公式（3）計(jì)算CAT活力。

式中：271為說明書提供參數(shù)；60為反應(yīng)時(shí)間/min；對照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測樣。

1.3.2.5 GSH含量測定

二硫代二硝基甲苯與巰基化合物反應(yīng)產(chǎn)生黃色絡(luò)合物，通過測定420 nm波長處吸光度的變化即可得出GSH含量，設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法進(jìn)行。按照公式（4）計(jì)算GSH含量。

式中：307為GSH的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；對照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測樣；空白組為以試劑盒中的試劑1替代待測樣。

1.3.2.6 MDA含量測定

MDA與硫代巴比妥酸縮合形成紅色產(chǎn)物，通過測定532 nm波長處吸光度的變化即可得出MDA含量，設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法進(jìn)行。按照公式（5）計(jì)算MDA含量。

式中：對照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測樣；10 nmol/mL為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；標(biāo)準(zhǔn)組為以10 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品替代待測樣；空白組為以無水乙醇替代待測樣。

1.3.3 ROS水平測定

采用流式細(xì)胞儀將培養(yǎng)至指數(shù)生長末期的球等鞭金藻細(xì)胞在24、21、18、15 ℃條件下分別誘導(dǎo)不同的時(shí)間，每4 h以流式細(xì)胞儀檢測ROS水平，以倒置熒光顯微鏡鏡檢染色后細(xì)胞狀態(tài)。并設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟為：樣品以無菌磷酸鹽緩沖液洗滌去雜質(zhì)，10 000 r/min離心15 min，重復(fù)3 次，稀釋至106個(gè)/mL以下，各取1 mL在24 ℃條件下培養(yǎng)的細(xì)胞樣品作為對照，以0.5 μmol/L的終濃度進(jìn)行Fluo-3-AM（鈣離子熒光探針）染色，避光孵育15 min后上樣。流式細(xì)胞儀用氳離子激光激發(fā)光源，功率15 mW，發(fā)射光波長488 nm，F(xiàn)luo-3-AM的綠色熒光用525 nm/30 nm帶通濾片收集，應(yīng)用Cellquest軟件收集、儲存、處理數(shù)據(jù)。將各組細(xì)胞樣品以相同濃度染料染色后涂于玻片上，立即置于倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成的DCFH被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化生成的熒光性的DCF，可被倒置熒光顯微鏡檢測到，并照相記錄[10-12]。

1.3.4 DHA含量測定

采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）測定DHA含量，具體操作步驟如下。

1.3.4.1 多不飽和脂肪酸的提取

以76 mL乙醇-氫氧化鉀溶液溶解1 g球等鞭金藻凍干粉，50 W超聲破碎20 min，70 ℃浸提1 h，抽濾，用乙醇洗滌濾餅，加入20 mL去離子水?dāng)U大體積，用正己烷萃取，HCl調(diào)整溶液pH值后，加入正己烷進(jìn)行皂化反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷，用尿素包埋溶液中的飽和脂肪酸或者單不飽和脂肪酸后－20 ℃冷凍保存2 h（此過程一直在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行）。

1.3.4.2 多不飽和脂肪酸甲酯化

在1 g球等鞭金藻粉所得的多不飽和脂肪酸中，加入硫酸-甲醇溶液置于75 ℃條件下水浴甲酯化1 h，反應(yīng)結(jié)束后加入生理鹽水和正己烷，振蕩混勻，靜置分層，取上層溶液，加入適量的無水硫酸鈉離心10 min，取上層溶液并用正己烷定容至10 mL，置于－20 ℃條件下保存。

1.3.4.3 DHA含量測定

采用GC法測定DHA含量。操作條件如下：色譜柱為HP-88型石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；色譜柱溫度：210 ℃，恒溫20 min，以3 ℃/min升溫至240 ℃，維持20 min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；FID檢測器溫度：260 ℃；進(jìn)樣方式：分流，分流比10∶1；進(jìn)樣量：1 μL；載氣：高純氮?dú)猓?9.99%）。

1.3.4.4 DHA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取不同質(zhì)量濃度DHA-甲酯對照品溶液，分別進(jìn)樣1.0 μL，測定峰面積響應(yīng)值，分別以DHA-甲酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程y=947.32x－4 032.5（R2=0.999 1）。表明在DHA-甲酯質(zhì)量濃度為2 000～20 000 μg/mL范圍內(nèi)，色譜峰面積與DHA-甲酯含量線性關(guān)系良好。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 球等鞭金藻在最適溫度下的生長特性

圖1 球等鞭金藻3011在24 ℃條件下的生長曲線（n==33）Fig.1 Growth curve of Isochrysis galbana 3011 at 24 ℃(n = 3)

圖1 為球等鞭金藻細(xì)胞在最適溫度（24 ℃）下培養(yǎng)測得的生長曲線，該曲線的回歸方程為y=0.000 2x5－0.003 6x4－0.082 1x3+2.274 0x2－5.108 2x（R2= 0.993 5）。球等鞭金藻的生長特點(diǎn)如下：第1～4天為生長停滯期，第5～10天為指數(shù)生長期，第11～13天為指數(shù)生長末期，第14～18天為靜止期，第19天之后進(jìn)入細(xì)胞衰亡期。本研究選取生物量最高的指數(shù)末期（第11天）作為低溫誘導(dǎo)時(shí)間，同時(shí)后續(xù)實(shí)驗(yàn)將最適溫度（24 ℃）設(shè)置為對照組。

2.2 低溫環(huán)境對球等鞭金藻抗氧化系統(tǒng)的影響

2.2.1 低溫誘導(dǎo)對球等鞭金藻SOD活性的影響

圖2 低溫誘導(dǎo)對球等鞭金藻SOD活性的影響Fig.2 Effect of low temperature on SOD activity

不同溫度對球等鞭金藻SOD活性的影響見圖2。當(dāng)?shù)蜏卣T導(dǎo)時(shí)間少于18 h時(shí)，與對照組比較，其他處理組的球等鞭金藻SOD活力均顯著提高，而且誘導(dǎo)溫度越低，SOD活力提高程度越大。隨著處理時(shí)間延長，15、18、21 ℃處理組的球等鞭金藻SOD活力又依次開始下降，這3 個(gè)處理組球等鞭金藻SOD活力的最大值分別為1 079.63、1 009.2、849.27 U/mg，比對照組分別提高了179%、168%和141%。

2.2.2 低溫誘導(dǎo)對球等鞭金藻CAT活性的影響

不同溫度對球等鞭金藻CAT活性的影響見圖3。球等鞭金藻經(jīng)過較短時(shí)間（少于18 h）的低溫誘導(dǎo)時(shí)，與對照組比較，球等鞭金藻的CAT活力顯著提高，而且誘導(dǎo)溫度越低，CAT活力提高程度越大。隨著處理時(shí)間的延長，15 ℃處理組的球等鞭金藻CAT活性在18 h后開始下降，18 ℃處理組則發(fā)生在24 h之后，而21 ℃處理組在30 h之后才開始有緩慢下降。15、18、21 ℃處理組球等鞭金藻CAT活力的最大值分別為332.05、318.90、282.47 U/mg，比對照組分別提高了1.73、1.67、1.47 倍。

圖3 低溫誘導(dǎo)對球等鞭金藻CAT活性的影響Fig.3 Effect of low temperature on CAT activity

2.2.3 低溫誘導(dǎo)對球等鞭金藻POD活性的影響

圖4 低溫誘導(dǎo)對球等鞭金藻POD活性的影響Fig.4 Effect of low temperature on POD activity

低溫對球等鞭金藻POD活性的影響如圖4所示，在低溫誘導(dǎo)18 h內(nèi)，與對照組相比，球等鞭金藻POD酶活力有明顯提高，并且誘導(dǎo)溫度越低，POD活力提高程度越大。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過18 h時(shí)，15 ℃處理組的球等鞭金藻POD活力開始下降，6 h后（24 h時(shí)）18 ℃處理組POD活力也開始下降，當(dāng)?shù)蜏卣T導(dǎo)至30 h時(shí)，21 ℃處理組的POD活力開始緩慢下降。48 h時(shí)，15、18 ℃處理組的POD活力已經(jīng)低于對照組。15、18、21 ℃處理組球等鞭金藻的POD活力最大值分別為217.40、214.67、202.33 U/mg，比對照組分別提高了152%、150%、142%。

2.2.4 低溫誘導(dǎo)對球等鞭金藻GSH含量的影響

圖5 低溫誘導(dǎo)對球等鞭金藻GSH含量的影響Fig.5 Effect of low temperature on GSH content

如圖5所示，3 個(gè)低溫誘導(dǎo)處理組的球等鞭金藻GSH含量均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，但與上述3 種酶的區(qū)別在于48 h內(nèi)，3 個(gè)低溫誘導(dǎo)處理組的球等鞭金藻GSH含量始終高于對照組。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間少于18 h時(shí)，與對照組相比，GSH含量明顯提高，而且溫度越低，GSH含量增加速率越快。隨著處理時(shí)間的延長，15 ℃處理組的球等鞭金藻GSH含量在18 h時(shí)開始下降，18 ℃處理組在24 h時(shí)GSH含量下降， 21 ℃處理組在30 h之后才開始緩慢下降。21、18、15 ℃處理組球等鞭金藻的GSH含量最大值分別為613.65、773.68、782.76 mg/g pro，比對照組分別提高了1.53、1.93、1.95 倍。

2.2.5 低溫誘導(dǎo)對球等鞭金藻MDA含量的影響

圖6 低溫誘導(dǎo)對球等鞭金藻MDA含量的影響Fig.6 Effect of low temperature on MDA content

圖6 顯示了由低溫所引起的球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量的變化，與對照組比較，各處理組球等鞭金藻在短時(shí)間（24 h內(nèi)）的低溫誘導(dǎo)處理下的MDA含量并無差異（P＞0.05）。隨著處理時(shí)間的延長，在30 h 時(shí)15 ℃處理組的球等鞭金藻MDA含量最先開始增加，6 h后（36 h 時(shí)）18 ℃處理組的MDA含量也出現(xiàn)了顯著增加，而21 ℃處理組則是在48 h時(shí)才檢測到MDA含量的存在。15、18、21 ℃處理組球等鞭金藻在48 h時(shí)的MDA含量分別為2.987、2.477、1.00 nmol/mg pro。

總之，球等鞭金藻3011經(jīng)低溫誘導(dǎo)，其細(xì)胞內(nèi)SOD、POD和CAT活力以及GSH含量均顯著提高。副產(chǎn)物MDA的水平受誘導(dǎo)溫度和時(shí)間的雙重影響，低溫長時(shí)環(huán)境中MDA水平增加明顯。因此，誘導(dǎo)溫度越低，處理時(shí)間越長，對球等鞭金藻的正常生理代謝影響越大，引起細(xì)胞膜的損傷程度越高，從而導(dǎo)致球等鞭金藻細(xì)胞偏離正常水平生長。而合適的環(huán)境刺激（有效的低溫和適當(dāng)?shù)臅r(shí)間）能使細(xì)胞有足夠強(qiáng)烈的防御響應(yīng)，誘導(dǎo)其加強(qiáng)合成DHA，同時(shí)對球等鞭金藻細(xì)胞本身的損傷較小。為此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了不同溫度和時(shí)間誘導(dǎo)下球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，以確定適合DHA積累的最佳溫度和時(shí)間。

2.3 低溫誘導(dǎo)下球等鞭金藻的ROS水平

ROS為具有化學(xué)活性的含氧分子，主要包括超氧陰離子自由基、過氧化氫和羥自由基，因?yàn)楹送馕磁鋵﹄娮拥拇嬖冢琑OS具有很強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性[13]。伴隨著機(jī)體正常呼吸代謝過程中，會產(chǎn)生一定量的ROS，這些ROS很快被細(xì)胞中的抗氧化酶或還原性物質(zhì)清除掉。然而，當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境（例如低溫）影響時(shí)，ROS的生成量會急劇增多，超過機(jī)體自身的清除能力，過多的ROS可以使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞。圖7是球等鞭金藻細(xì)胞在18 ℃條件下誘導(dǎo)4、20 h時(shí)ROS的產(chǎn)生狀況。而球等鞭金藻在不同的低溫條件下誘導(dǎo)不同時(shí)間，其細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化情況見表1。當(dāng)受到較短時(shí)間的低溫誘導(dǎo)（少于12 h）時(shí)，低溫處理組與對照組（24 ℃處理組）的ROS水平差異不顯著。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，ROS水平呈現(xiàn)出不同程度地增加，21 ℃處理組的球等鞭金藻ROS含量緩慢增加，在24 h時(shí)出現(xiàn)最大值為（9.18±0.52）%；15、18 ℃處理組誘導(dǎo)16 h時(shí)出現(xiàn)明顯的ROS水平爆發(fā)，與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05），這兩組在20 h時(shí)球等鞭金藻的ROS水平出現(xiàn)最大值分別為（14.11±0.11）%和（14.74±0.58）%。

圖7 18 ℃誘導(dǎo)4 h（a）和20 h（b）球等鞭金藻3011的DCFH-DA染色熒光結(jié)果Fig.7 DCFH-DA staining fluorescence of Isochrysis galbana 3011 induced at 18 ℃ for 4 (a) and 20 h (b)

表1 溫度對球等鞭金藻3011 ROS水平的影響Table 1 Effect of low temperature on ROS level of Isochrysis galbana 3011

2.4 低溫誘導(dǎo)下球等鞭金藻的DHA產(chǎn)量

18 ℃誘導(dǎo)24、48 h后，球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的DHA水平分別為0.105、0.092 mg/g，而對照組（24 ℃，24 h）的DHA水平為0.045 mg/g。即經(jīng)過18 ℃誘導(dǎo)24 h后球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的DHA含量比對照組高出1 倍多。因此，低溫誘導(dǎo)是提高球等鞭金藻DHA產(chǎn)量的十分有效的方法。

3 結(jié)論與討論

正常情況下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除是處于平衡狀態(tài)的，此時(shí)機(jī)體ROS含量較低，對機(jī)體不會造成任何傷害。當(dāng)受到環(huán)境脅迫（如低溫）時(shí)，細(xì)胞膜的流動性降低，并產(chǎn)生大量ROS，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致MDA的積累。最初ROS被認(rèn)為是氧化代謝中具很強(qiáng)毒性作用的副產(chǎn)物[14]，但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)ROS在動植物的許多生理代謝過程中均具有害和有利的雙重功能[15]，適量的ROS可以作為生物開啟防御機(jī)制的重要信號，誘導(dǎo)許多參與防衛(wèi)功能的次生代謝產(chǎn)物的生物合成及相關(guān)基因的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過低溫誘導(dǎo)后，球等鞭金藻的抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化的還原性物質(zhì)（GSH）水平均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且酶活性以及含量均高于對照組，此結(jié)果與他人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[16-21]。短時(shí)間低溫條件下，這些酶的活性和抗氧化物質(zhì)含量迅速增加，通過協(xié)同作用減輕由于ROS含量增加所引起的脂質(zhì)過氧化，維持細(xì)胞的正常代謝。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，抗氧化物質(zhì)能量逐漸減小，酶活性逐漸下降，引起脂質(zhì)過氧化作用。因此，過量的ROS較長時(shí)間地作用于細(xì)胞，對細(xì)胞而言是一種傷害。因此，當(dāng)在恰當(dāng)?shù)牡蜏貤l件下作用適當(dāng)?shù)臅r(shí)間時(shí)，一方面可以誘導(dǎo)細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生ROS，另一方面ROS作用于逆境信號，激活機(jī)體的防御響應(yīng)，同時(shí)通過提高抗氧化酶的活性和還原性物質(zhì)的含量來消除ROS對機(jī)體自身的不良影響。已有實(shí)驗(yàn)表明，適當(dāng)?shù)牡蜏乜梢源龠M(jìn)多不飽和脂肪酸的積累[22-23]。但長時(shí)間的低溫誘導(dǎo)會導(dǎo)致ROS的過度積累，使多不飽和脂肪酸的雙鍵發(fā)生過氧化作用[24]，產(chǎn)生MDA。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，球等鞭金藻經(jīng)過18 ℃誘導(dǎo)24 h后，其細(xì)胞內(nèi)DHA水平比對照組提高了0.06 mg/g，延長誘導(dǎo)時(shí)間或是降低誘導(dǎo)溫度均會導(dǎo)致DHA含量下降，這也與他人的研究結(jié)果相似[25]。

現(xiàn)如今關(guān)于ROS、抗氧化酶以及DHA對低溫的防御機(jī)理有兩種理論：1）低溫誘導(dǎo)引起ROS水平爆發(fā)，抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行主動防御，適量的ROS作為信號分子引起相關(guān)去飽和酶基因的表達(dá)，提高了脂肪酸的不飽和度，恢復(fù)細(xì)胞膜脂質(zhì)的流動性，以保持其正常的生理功能，提高對低溫的耐受能力；2）DHA作為非酶促小分子抗氧化物質(zhì)，與抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)共同作用，清除低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS[26-27]。在受到低溫誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞膜首先受到傷害，其通透性下降，并發(fā)生膜相變，同時(shí)引起ROS水平的爆發(fā)，抗氧化系統(tǒng)在短時(shí)間內(nèi)可以進(jìn)行主動防御，消除ROS過量積累引起的傷害，適量ROS的積累可以作為信號分子誘導(dǎo)細(xì)胞防御基因的表達(dá)，激活信號通對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行重新修飾[28]，使機(jī)體脂類代謝、次生代謝、激素合成及代謝等相關(guān)基因的表達(dá)有明顯改變[29-30]，保證機(jī)體對低溫的適應(yīng)性，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累。但是當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間過長時(shí)，ROS的產(chǎn)生量過多，且抗氧化酶活性下降，會造成次生代謝產(chǎn)物的積累下降，同時(shí)MDA含量增加。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性與溫度成負(fù)相關(guān)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，酶的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，溫度越低，MDA越早出現(xiàn)。ROS水平爆發(fā)最早出現(xiàn)在15 ℃和18 ℃誘導(dǎo)16 h時(shí)，18 ℃誘導(dǎo)20 h有（14.74±0.58）%的細(xì)胞發(fā)生ROS水平爆發(fā)，與對照組比較均具有顯著差異（P＜0.05）。18 ℃誘導(dǎo)24 h的球等鞭金藻DHA產(chǎn)量比24 ℃誘導(dǎo)24 h高0.06 mg/g。

適當(dāng)?shù)牡蜏丨h(huán)境可以作為誘導(dǎo)子引起球等鞭金藻的ROS相關(guān)酶活性的升高，ROS的適量積累可促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物合成。本研究為提高球等鞭金藻細(xì)胞DHA產(chǎn)量和利用球等鞭金藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)DHA提供了參考依據(jù)。

[1] 周筱娟. 低溫誘導(dǎo)的植物抗凍基因研究進(jìn)展[J]. 紹興文理學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004, 24(9): 65-69. DOI:10.3969/j.issn.1008-293X.2004.09.017.

[2] 宰學(xué)明, 吳國榮, 陸長梅, 等. 低溫預(yù)處理對大豆萌芽活力及其活性氧代謝的影響[J]. 大豆科學(xué), 2001, 20(3): 163-166. DOI:10.3969/ j.issn.1000-9841.2001.03.002.

[3] 朱素琴. 高鹽/低溫脅迫下水稻葉細(xì)胞內(nèi)ASC的氧化還原狀態(tài)和外源ABA的作用研究[D]. 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2011: 12.

[4] WINSTON S W, DIGIULIO R T. Prooxidant and antioxidant mechanisms in aquatic organisms[J]. Aquatic Toxicology, 1991, 19(2): 137-161. DOI:10.1016/0166-445X(91)90033-6.

[5] YOSHIOKA H, ASAI S, YOSHIOKA M, et al. Molecular mechanisms of generation for nitric oxide and reactive oxygen species, and role of the radical burst in plant immunity[J]. Molecules and Cells, 2009, 28(4): 321-329. DOI:10.1007/s10059-009-0156-2.

[6] TAMAS L, MISTRIK I, HUTTOVA J, et al. Role of reactive oxygen species generating enzymes and hydrogen peroxide during cadmium mercury and osmotic stresses in barley root tip[J]. Planta, 2010, 231(2): 221-231. DOI:10.1007/s00425-009-1042-z.

[7] PU G B, MA D M, CHEN J L, et al. Salicylic acid activates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L.[J]. Plant Cell Reports, 2009, 28(7): 1127-1135. DOI:10.1007/s00299-009-0713-3.

[8] ZHAO J, HU Q, GUO Y Q, et al. Elicitor-induced indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus cell cultures is related to Ca2+influx and the oxidative burst[J]. Plant Science, 2001, 161(3): 423-431. DOI:10.1016/S0168-9452(01)00422-8.

[9] 林武杰, 吳云輝. 海洋微藻多不飽和脂肪酸研究進(jìn)展[J]. 福建水產(chǎn), 2013, 35(1): 78-82. DOI:10.3969/j.issn.1006-5601.2013.01.014.

[10] 趙培, 王雪青, 陳慶森, 等. Zn2+對球等鞭金藻3011細(xì)胞膜電位和膜通透性的影響[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(5): 66-70.

[11] 趙培, 王雪青, 彭博麗, 等. 熒光分析法檢測金藻對Zn2+的利用[J]. 食品研究與開發(fā), 2011, 32(8): 87-90. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2011.08.027.

[12] 趙培, 王雪青, 魏丹, 等. 赤霉素對球等鞭金藻3011生物量、細(xì)胞形態(tài)與不同生長時(shí)期群體細(xì)胞活性的影響[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2011, 28(5): 383-386.

[13] 王海波, 黃雪梅, 張昭其. 植物逆境脅迫中活性氧和鈣信號的關(guān)系[J].北方園藝, 2010(22): 189-194.

[14] 張怡, 路鐵鋼. 植物中的活性氧研究概述[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展, 2011, 1(4): 242-248.

[15] ZHOU D, SHAO L, SPITZ D R. Reactive oxygen species in normal and tumor stem cells[J]. Advances in Cancer Research, 2014, 122: 1-67. DOI:10.1016/B978-0-12-420117-0.00001-3.

[16] 毛永強(qiáng). 低溫下脅迫螺旋藻(節(jié)旋藻)幾種氧化還原酶的研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古師范大學(xué), 2007: 3-17.

[17] 劉娟妮, 王雪青, 龐廣昌. 溫度和光照對極大螺旋藻多糖含量和SOD酶活力的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(9): 132-134.

[18] RADY A A, EI-SHEEKH M M, MATKOVICS B. Temperature shift induced changes in the antioxidant enzyme system of Cyanobacterium ynechocystis PCC 6803[J]. International Journal of Biochemistry, 1994, 26(3): 433-435. DOI:10.1016/0020-711X(94)90064-7.

[19] 闞光鋒. 南極冰藻Chlamydomona sp. L4的逆境適應(yīng)性及其抗逆蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2005: 26-33.

[20] 丁燏, 繆錦來, 王全富, 等. 溫度對南極衣藻ICE-L(Chlamydomonas sp. ICE-L)谷胱甘肽含量及其相關(guān)酶活性的影響[J]. 海洋與湖沼, 2006, 37(2): 154-161. DOI:10.3321/j.issn:0029-814X.2006.02.009.

[21] 夏利花, 何劍鋒, 高巖, 等. 三種北極微藻對不同溫度的適應(yīng)性研究[J].極地研究, 2009, 21(4): 279-287.

[22] 郭兵, 龔陽, 萬霞, 等. 光強(qiáng)和溫度對球等鞭金藻(Isochrysis sphaerica)生長及其脂肪酸的影響[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào), 2011, 33(3): 295-301.

[23] CONVERTI A, CASAZZA A A, ORTIZ E Y, et al. Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production[J]. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 2009, 48(6): 1146-1151. DOI:10.1016/ j.cep.2009.03.006.

[24] CAI Fang, DUPERTUIS Y M, PICHARD C. Role of polyunsaturated fatty acids and lipid peroxidation on colorectal cancer risk and treatments[J]. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care, 2012, 15(2): 99-106. DOI:10.1097/MCO.0b013e32834feab4.

[25] 蔣漢明, 翟靜, 張媛英, 等. 溫度對海洋微藻生長及脂肪酸組成的影響[J]. 食品研究與開發(fā), 2005, 26(6): 9-12. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2005.06.003.

[26] FISARAKIS I, CHARTZOULAKIS K, STAVRAKAS D. Response of Sultana vines (V. vinifera L.) on six rootstocks to NaCl salinity exposure and recovery[J]. Agricultural Water Management, 2001, 51(1): 13-27. DOI:10.1016/S0378-3774(01)00115-9.

[27] 范博. 低溫脅迫下ABA誘導(dǎo)冬小麥抗氧化防護(hù)系統(tǒng)的研究[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 6.

[28] 程艷麗, 宋純鵬. 植物細(xì)胞H2O2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[J]. 中國科學(xué): 生命科學(xué), 2005, 35(6): 480-489. DOI:10.3321/ j.issn:1006-9259.2005.06.001.

[29] GECHEV T, WILLEKENS H, van MONTAGU M, et al. Different responses of tobacco antioxidant enzymes to light and chilling stress[J]. Journal of Plant Physiology, 2003, 160(5): 509-515. DOI:10.1078/0176-1617-00753.

[30] SUZUKI N, SEJIMA H, TAM R, et al. Identification of the MBF1 heat-response regulon of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal, 2011, 66(5): 844-851. DOI:10.1111/j.1365-313X.2011.04550.x.

Effect of Low Environmental Temperature on Antioxidant System and DHA Content in Isochrysis galbana 3011

WANG Ting, ZHAO Pei, WANG Xueqing*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Effects of low environmental temperature on the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT), and the contents of glutathione peroxidase (GSH), malondialdehyde (MDA), docosahexaenoic acid (DHA) and reactive oxygen species (ROS) in Isochrysis galbana 3011 were investigated for exploring the relationship among antioxidant enzyme activities, ROS levels and DHA contents at different temperatures. The enzyme activities were determined by corresponding kits. ROS levels were detected by flow cytometry and inverted fluorescence microscope, and DHA contents were determined by gas chromatography (GC). The results showed that activities of SOD, CAT and POD increased firstly and then decreased with increasing culture time at 15, 18 and 21 ℃. Lower temperature could result in earlier and higher enzyme activity peaks followed by a faster decline. The profile of GSH was similar to that of antioxidant enzyme activities, while content of MDA increased continuously. ROS levels showed a complex change with declining temperature, and ROS burst was appeared after induction for 16 h at 15 and 18 ℃, with maximum values of (14.11 ± 0.11)% and (14.74 ± 0.58)% at 20 h, respectively (P ＜ 0.05). DHA was 0.105 mg/g at 18 ℃ for 24 h, which was higher than that at 24 ℃ for 24 h by 0.06 mg/g. Therefore, low environmental temperature can improve the levels of metabolic products by activating microalgae defense responses, increasing ROS-related enzyme activities, ROS levels and DHA contents.

Isochrysis galbana 3011; antioxidant; low temperature; reactive oxygen species (ROS); docosahexaenoic acid

10.7506/spkx1002-6630-201601023

TS207.3

A

1002-6630（2016）01-0126-07

王婷, 趙培, 王雪青. 低溫環(huán)境對球等鞭金藻3011抗氧化系統(tǒng)和二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 126-132.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601023. http://www.spkx.net.cn

WANG Ting, ZHAO Pei, WANG Xueqing. Effect of low environmental temperature on antioxidant system and DHA content in Isochrysis galbana 3011[J]. Food Science, 2016, 37(1): 126-132. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601023. http://www.spkx.net.cn

2015-02-11

天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20120603）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31270050； 31071522；31171674）

王婷（1989—），女，碩士研究生，主要從事微藻生理生化研究。E-mail：xuantingqian@aliyun.com

*通信作者：王雪青（1964—），女，教授，博士，主要從事天然活性物質(zhì)研究。E-mail：wxqing@tjcu.edu.cn