海帶多糖及其純化組分的膽酸鹽吸附能力及抗氧化活性

王智榮，崔 春*，林宗毅，黃俊偉

海帶多糖及其純化組分的膽酸鹽吸附能力及抗氧化活性

王智榮，崔 春*，林宗毅，黃俊偉

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

采用pH 2的檸檬酸溶液提取海帶中的多糖，將海帶多糖（polysaccharide from Laminaria japonica，LPA-P）通過(guò)Sevag法除蛋白、透析除鹽處理、離子交換柱處理，分離純化得到3 種多糖組分LPA-P1、LPA-P2、LPA-P3，探討了海帶多糖的分子質(zhì)量、硫酸基含量、單糖組成與其抗氧化能力和膽酸鹽吸附能力的內(nèi)在聯(lián)系。結(jié)果表明：LPA-P及其純化組分均含有硫酸基，且LPA-P3最多為5.36%，LPA-P1最少為1.22%；海帶多糖及其純化組分的單糖組成均以巖藻糖、半乳糖和甘露糖為主，其中LPA-P和LPA-P3主要的單糖為半乳糖，而LPA-P1和LPA-P2主要的單糖為甘露糖，海帶多糖LPA-P3中巖藻糖含量最高；海帶多糖LPA-P、LPA-P1、LPA-P2和LPA-P3的平均分子質(zhì)量為20.13、17.55、28.71、17.14 kD。海帶多糖的氧自由基吸收能力和2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azinobis (3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid) ammonium salt radical，ABTS+·）清除能力從大到小依次為L(zhǎng)PA-P3＞LPA-P＞LPA-P2＞LPA-P1；LPA-P3具有最強(qiáng)的膽酸鹽吸附能力，LPA-P和LPA-P2次之且無(wú)顯著性差異，LPA-P1基本不具有膽酸鹽吸附能力。結(jié)合LPA-P及其純化組分的結(jié)構(gòu)特性，推測(cè)高硫酸基含量、主要單糖組成為巖藻糖和半乳糖的海帶多糖具有更強(qiáng)的膽酸鹽吸附能力及抗氧化活性。

海帶；多糖；膽酸鹽吸附能力；抗氧化活性

海帶屬于褐藻門海帶目海帶科海帶屬的一種大型海藻，是一種重要的經(jīng)濟(jì)海藻[1-2]。我國(guó)在很早之前就有食用海帶的歷史，并將海帶作為中藥入藥。隨著藥理學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)的發(fā)展，海帶越來(lái)越多的生物活性被發(fā)現(xiàn)，如：降血糖、抗動(dòng)脈硬化、抗凝血、抗腫瘤調(diào)節(jié)免疫等[3-6]，研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖（polysaccharide from Laminaria japonica，LPA-P）是海帶具有多種多樣的生理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

LPA-P是存在于海帶細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的一類生物大分子，其生物活性與結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)[7]。膽酸鹽是一類具有甾核結(jié)構(gòu)的兩性大分子，對(duì)人體脂肪和膽固醇的消化吸收和脂溶性維生素的代謝起重要作用，它由肝臟的膽固醇形成，并會(huì)重吸收進(jìn)入肝臟形成膽固醇，從而形成膽固醇的膽肝循環(huán)。因此，減少腸道內(nèi)的膽酸鹽對(duì)降血脂有著重要作用[8-10]。活性物質(zhì)的活性評(píng)價(jià)方法多為其對(duì)膽酸鹽吸附作用的測(cè)定，其中膽酸鹽多采用膽酸鈉、脫氧膽酸鈉和牛磺膽酸鈉，其中牛磺膽酸鈉最為難以被吸附，膽酸鹽濃度的測(cè)定，一般采用紫外吸收法以及糠醛硫酸法[11]。本課題組盧茳虹等[12-13]前期研究了響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬酸法從海帶渣中提取LPA-P的方法，并研究了其抗氧化活性。Zhao Xue等[14]利用酸水解和快速降解的方法制備LPA-P，并研究了分子質(zhì)量對(duì)抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量更小的LPA-P，在清除超氧陰離子自由基（O2－·）的抗氧化能力上有著更好的表現(xiàn)。Saha等[15]發(fā)現(xiàn)LPA-P的硫酸基含量越高的組分具有更強(qiáng)的抗病毒活性和抗氧化能力。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸提取海帶中的多糖，通過(guò)除蛋白、透析除鹽、離子交換柱等分離方法得到成分較為均一的LPA-P組分，研究了LPA-P分子質(zhì)量、硫酸基含量、單糖組成等，并結(jié)合其抗氧化能力和膽酸鹽吸附能力探究LPA-P生物活性與結(jié)構(gòu)特征的聯(lián)系，以期為海帶的綜合利用和深加工提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶，采購(gòu)于山東省煙臺(tái)，采收于九月，清洗后曬干，粉碎過(guò)40 目篩，置于干燥器中貯存?zhèn)溆谩?/p>

無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸羥胺、K2S2O8、糠醛、氫氧化鈉、氫氧化鉀 廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、濃硫酸、二甲基亞砜 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；吡啶、氯仿、碘甲烷、正丁醇、二氯甲烷 天津市大茂化學(xué)試劑廠；Trolox、2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、熒光素鈉鹽（fluorescein sodium，F(xiàn)L） 美國(guó)Sigma公司；二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）美國(guó)GE公司；色譜級(jí)甲醇 北京迪馬科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；7890A氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；高效凝膠滲透色譜儀 美國(guó)Waters公司；ALPHA1-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Unico UV-2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 江陰市保利科研器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖提取流程

海帶干粉→檸檬酸提取（pH 2的檸檬酸溶液（1∶30，m/V），溫度120 ℃，時(shí)間3 h）→取上清液，用氫氧化鉀調(diào)pH值至中性→濃縮→醇沉（乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為80%）→4 ℃條件下靜置8 h→取沉淀物→復(fù)溶沉淀物→海帶粗多糖

1.3.2 Sevag法除蛋白

參考Navarini等[16]的方法。以5∶1（V/V）配制氯仿-正丁醇溶液（Sevag試劑），保存以備用。取海帶粗多糖溶液，加入多糖溶液1/5體積的Sevag試劑，室溫條件下振蕩反應(yīng)30 min。充分反應(yīng)后離心取上清液，重復(fù)上述步驟5～6 次直到不再出現(xiàn)沉淀或極少沉淀。除蛋白后的多糖溶液使用乙醇醇沉，使乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為80%，在0～4 ℃條件下靜置8～12 h，離心取沉淀，并溶于蒸餾水，得除蛋白多糖的溶液。

1.3.3 透析法除鹽

選取截留量為800～1 400 D的透析袋，將除蛋白多糖溶液置于透析袋中，用去離子水透析72 h，每隔約4 h換水一次。透析完成后樣品溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至適合體積，冷凍干燥得多糖固體。

1.3.4 LPA-P的柱層析分離

采用規(guī)格為2.6 cm×20 cm的玻璃柱，用DEAE填料裝柱，用0.2 mol/L的NaOH溶液沖洗40 min，1 mol/L的NaCl溶液沖洗60 min，最后用去離子水沖洗填料至中性。分別配制0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol/L濃度的NaCl溶液保存以備用，取0.8 g LPA-P固體溶于去離子水，并將樣品上柱，每個(gè)濃度洗脫3～10 個(gè)柱體積，洗脫流速為5 mL/min，每試管收集5 mL的洗脫液。根據(jù)每管洗脫液的多糖含量，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，多糖測(cè)定的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。收集不同組分樣品，把不同濃度NaCl溶液洗脫下來(lái)的洗脫液分別收集，濃縮，通過(guò)透析除去NaCl，冷凍干燥，獲得LPA-P1、LPA-P2和LPA-P3。

1.3.5 LPA-P硫酸基含量的測(cè)定

采用硫酸鋇比濁法[17]測(cè)定。

1.3.6 LPA-P單糖組成的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]中的方法測(cè)定LPA-P中的單糖組成。

1.3.7 氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）值測(cè)定

參照Huang Wuyang等[19]的方法并加以改進(jìn)。熒光素鈉鹽（fluorescein sodium，F(xiàn)L）、自由基產(chǎn)生劑2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽）（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH）、標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)VE水溶性類似物（Trolox）以及待測(cè)樣品均用75 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液溶解稀釋。在96 孔板各個(gè)微孔中依次加入緩沖溶液、樣品、70 nmol/L FL各20 μL后，在37 ℃條件下放置15 min，之后迅速在各孔中加入12.8 mmol/L AAPH 140 μL后運(yùn)行程序，在37 ℃條件下以激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)538 nm進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，每2 min測(cè)定一次各孔熒光強(qiáng)度，測(cè)定120 min，熒光強(qiáng)度分別記為f0、f1、f2f60。將各個(gè)微孔不同時(shí)間記錄下的絕對(duì)熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)fi與初始的熒光強(qiáng)度f(wàn)0作比，折算成相對(duì)熒光強(qiáng)度，并按照下式計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC）值：

再根據(jù)公式（2），分別計(jì)算不同濃度下（0～100 μmol/L）Trolox和LPA-P的Net AUC值：

式中：AUC空白為沒(méi)有抗氧化劑存在時(shí)自由基作用對(duì)照的AUC值。

以Net AUC值為縱坐標(biāo)，Trolox濃度為橫坐標(biāo)建立直線回歸方程，根據(jù)回歸方程計(jì)算LPA-P的ORAC值。

1.3.8 ABTS+·清除能力的測(cè)定[20]

將等量混合的14 mmol/L ABTS水溶液和4.9 mmol/L K2S2O8水溶液，在室溫避光條件下靜置12～16 h以制備ABTS+·儲(chǔ)備液。測(cè)定時(shí)，用50%乙醇溶液稀釋ABTS，使其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度在0.70±0.02范圍內(nèi)，形成ABTS+·測(cè)定液。將0.1 mL樣品用ABTS+·測(cè)定液稀釋至3 mL，振蕩30 s，在30 ℃條件下反應(yīng)20 min后在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai。對(duì)照組A0是以0.1 mL水作同樣處理。

1.3.9 多糖膽酸鹽吸附率的測(cè)定

參照周小理等[21]的方法，并做一定修改。配制質(zhì)量濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取樣液（或各不同質(zhì)量濃度的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液）1 mL于具塞試管中，加入6 mL體積分?jǐn)?shù)為45%的硫酸，混勻，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為0.3%的糠醛，混勻，置65 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后，于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

配制4 mg/mL牛磺膽酸鈉溶液，加入2 mg/mL的多糖樣品，以蒸餾水作為空白對(duì)照，于37 ℃恒溫下反應(yīng)1 h后，5 000 r/min離心分離10 min。準(zhǔn)確移取1 mL上清液，于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其膽酸鹽的質(zhì)量濃度。再根據(jù)添加多糖樣品及空白溶液中膽酸鹽的濃度差計(jì)算多糖對(duì)膽酸鹽的吸附量。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPA-P的DEAE柱分離

圖1 海帶多糖洗脫曲線Fig.1 DEAE-Sepharose fast flow chromatogram of LPA-P

如圖1所示，LPA-P經(jīng)過(guò)DEAE柱吸附后，在0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl的洗脫濃度下得到3 個(gè)明顯的峰形，在0、0.4、0.5 mol/L NaCl的洗脫濃度下峰面積較小。分別對(duì)0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl的洗脫濃度進(jìn)行收集，經(jīng)過(guò)透析脫鹽，冷凍干燥后得到海帶多糖LPA-P1、LPA-P2、LPA-P3這3 個(gè)組分。

2.2 LPA-P各組分硫酸基含量

表1 LPA-P及其純化組分硫酸基含量Table 1 Contents of sulfated group in LPA-P and its fractions

由表1可知，隨著洗脫液鹽濃度的增大，LPA-P1、LPA-P2、LPA-P3這3 個(gè)組分的硫酸基含量依次增高，這可能是因?yàn)镈EAE作為一種陰離子交換填料，可以分離帶電荷的多糖[22]，因此，隨著洗脫液鹽濃度的增大，多糖酸性強(qiáng)度也不斷增大，所以表現(xiàn)出更高的硫酸基含量。

Wang Jing[23]和Saha[15]等的研究表明，硫酸基含量與多糖抗氧化活性成正比，且與抗病毒等生物活性密切相關(guān)，因此可推測(cè)LPA-P3組分具有更強(qiáng)抗氧化性和生物活性。3 個(gè)分離純化組分中，存在1 個(gè)組分LPA-P1的硫酸基含量低于海帶粗多糖，而Saha等[15]從海帶粗多糖中分離純化出的3 個(gè)組分，其硫酸基含量均高于海帶粗多糖，這可能是因?yàn)樗捎玫奶崛》椒ú煌?/p>

2.3 LPA-P各組分的單糖組成

LPA-P及其純化組分各個(gè)單糖成分在氣相色譜柱中分離效果良好，通過(guò)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比和標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出LPA-P及其純化組分的單糖組成。

表2 LPA-P及其純化組分單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of LPA-P and its fractions

由表2可知，4 個(gè)組分均含有較為常見(jiàn)的6 種單糖，分別為鼠李糖、木糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖，但鼠李糖、葡萄糖和木糖的含量非常少，而含有大量的半乳糖、甘露糖和巖藻糖，其中LPA-P和LPA-P3的半乳糖含量占最大部分，LPA-P1和LPA-P2則是甘露糖含量最高。

半乳糖和巖藻糖是褐藻多糖中較為常見(jiàn)的單糖，也是巖藻多糖的主要單糖組成，而巖藻糖多糖已被報(bào)道具有較強(qiáng)的生物活性，其中包括抗血凝、抗氧化和抗病毒等[24]。Wang Jing等[23]的研究中也發(fā)現(xiàn)半乳糖含量更高組分的殺菌及抗氧化能力更強(qiáng)。LPA-P3組分的巖藻糖及半乳糖含量在4 個(gè)組分中最高，可推測(cè)LPA-P3具有更強(qiáng)的抗氧化性和生物活性。Saha等[15]研究發(fā)現(xiàn)狹葉海帶粗多糖及其分離純化出的3 個(gè)組分中單糖組成均以巖藻糖為主，且其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他單糖，單糖組成上的差異可能是因?yàn)楹У钠贩N不同。

2.4 LPA-P各組分分子質(zhì)量分布

多糖的分子質(zhì)量具有相對(duì)性，通常所測(cè)定的分子質(zhì)量只是一種統(tǒng)計(jì)平均值，代表相似鏈長(zhǎng)的平均值。采用凝膠滲透色譜法對(duì)經(jīng)過(guò)分離純化后的LPA-P、LPA-P1、LPA-P2、LPA-P3的分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。可看出LPA-P也是單峰，但峰形較寬且不太對(duì)稱，LPA-P1、LPA-P2、LPA-P3形成了峰形對(duì)稱均勻的單峰，說(shuō)明分離純化取得了較好的效果。

圖2 LPA-P（a）、LPA-P1（b）、LPA-P2（c）、LPA-P3（d）的分子質(zhì)量分布Fig.2 Molecular weights of LPA-P (a), LPA-P1 (b), LPA-P2 (c), and LPA-P3 (d)

由圖2a可知，LPA-P的平均分子質(zhì)量為20.13 kD，與傳統(tǒng)水提法得到的多糖平均分子質(zhì)量有了顯著的下降，且各純化組分與粗多糖的分子質(zhì)量相差不大，說(shuō)明檸檬酸法提取海帶多糖能有效地把多糖大分子水解成分子質(zhì)量更小的多糖，其中LPA-P3平均分子質(zhì)量最小，為17.14 kD。Zhao Xue等[14]利用酸水解和快速降解的方法制備海帶多糖，并研究了分子質(zhì)量對(duì)抗氧化活性的影響，其結(jié)果表明分子質(zhì)量更小的LPA-P，在清除超氧陰離子自由基的抗氧化能力上有著更好的表現(xiàn)。一般認(rèn)為分子質(zhì)量更小的多糖成分中的有效部分更容易與發(fā)生反應(yīng)的配體相接觸，從而使其活性更強(qiáng)；其次分子質(zhì)量更小的多糖成分更容易透過(guò)組織細(xì)胞到達(dá)產(chǎn)生活性的部位，從而使其活性加強(qiáng)。那么可推測(cè)LPA-P3組分會(huì)具有更好的抗氧化能力及生物活性。

2.5 LPA-P各組分抗氧化活性研究

2.5.1 LPA-P氧自由基吸收能力

圖3 LPA-P及其純化組分的氧自由基吸收能力Fig.3 Oxygen radical absorbance capacity of LPA-P and its fractions

由圖3可知，LPA-P與其分離純化后組分的氧自由基吸收能力有了顯著性差異。其中LPA-P3的ORAC值最高，達(dá)到650.93 μmol Trolox/g，比LPA-P組分的341.87 μmol Trolox/g提高了將近1 倍，是LPA-P2的近3 倍。而LPA-P1的氧自由基吸收能力則非常差，只有37.22 μmol Trolox/g。

2.5.2 LPA-P的ABTS+·清除能力

圖4 LPA-P及其純化組分的ABBTTSS＋·清除能力Fig.4 ABTS radical scavenging activity of LPA-P and its fractions

由圖4可知，LPA-P各組分的ABTS+·清除能力由大到小依次為L(zhǎng)PA-P3＞LPA-P＞LPA-P2＞LPA-P1，且均呈量效關(guān)系，隨多糖質(zhì)量濃度的上升而增強(qiáng)。在各個(gè)質(zhì)量濃度下，LPA-P3均表現(xiàn)出比LPA-P及其他2個(gè)組分更強(qiáng)的ABTS+·清除能力，并且隨著質(zhì)量濃度的上升，LPA-P3的清除能力增大得最快，而LPA-P1最慢。其中LPA-P3的IC50值為1.57 mg/mL，在2 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到60.06%。結(jié)合氧自由基吸收能力，兩種抗氧化指標(biāo)能得出比較一致的結(jié)論：LPA-P1的ABTS+·及氧自由基吸收能力最弱，LPA-P3最強(qiáng)，LPA-P和LPA-P2次之，但兩者間差距較小。

結(jié)合硫酸基含量來(lái)看，LPA-P3具有最高的硫酸基含量，為5.36%，而LPA-P和LPA-P2的硫酸基含量相差不大，分別為2.23%和2.29%，LPA-P1最少，為1.22%，與各組分的抗氧化指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)論十分相似。這與Saha等[15]在研究海帶多糖的抗病毒活性時(shí)得到的結(jié)論相一致：硫酸基含量高的組分具有更強(qiáng)的抗病毒活性和抗氧化能力。

從單糖組成上來(lái)看，LPA-P3具有最多的巖藻糖，而LPA-P和LPA-P2的巖藻糖含量相差不大，而LPA-P1的巖藻糖含量最少，并且LPA-P3的半乳糖含量最高，LPA-P也含有大量的半乳糖，而LPA-P2和LPA-P1則主要含有大量的甘露糖，可以看出巖藻糖和半乳糖所占比重越大，多糖的抗氧化能力越好。Wang Jing等[23]的研究中也發(fā)現(xiàn)半乳糖含量更高組分的殺菌及抗氧化能力更強(qiáng)。Xue Changhu等[25]在分離海帶多糖中也同樣得到一個(gè)半乳糖含量很高的多糖組分具有最強(qiáng)的抗氧化能力。

從各組分的分子質(zhì)量來(lái)看，LPA-P3和LPA-P1的分子質(zhì)量最小，為17.13 kD和17.55 kD，但LPA-P3的ABTS+·及氧自由基吸收能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LPA-P1，而LPA-P和LPA-P2的分子質(zhì)量也高于LPA-P1，這與Zhao Xue等[14]得出的結(jié)論不一致，并沒(méi)有表現(xiàn)出分子質(zhì)量越小的組分抗氧化能力越強(qiáng)的特征。

2.6 LPA-P各組分的膽酸鹽吸附率

圖5 LPA-P及其純化組分的膽酸鹽吸附率Fig.5 Cholate adsorption rate of LPA-P and its fractions

由圖5可知，LPA-P及其純化組分的膽酸鹽吸附能力與ABTS+·及氧自由基吸收能力相似。LPA-P3的膽酸鹽吸附能力最強(qiáng)，為23.85%；而LPA-P和LPA-P2無(wú)顯著性差異，分別為13.90%和13.75%。LPA-P1的膽酸鹽吸附率幾乎為0%，可認(rèn)為L(zhǎng)PA-P1組分不具有膽酸鹽吸附能力。

對(duì)比抗氧化指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可看出多糖的膽酸鹽吸附能力與其抗氧化能力有著很高的相關(guān)性，具有更強(qiáng)ABTS+·及氧自由基吸收能力的多糖其膽酸鹽吸附能力會(huì)更高。這可能是由于影響ABTS+·及氧自由基吸收能力的分子基團(tuán)和結(jié)構(gòu)同樣會(huì)影響多糖與膽酸鹽絡(luò)合的能力。ABTS+·及氧自由基吸收能力強(qiáng)的多糖，其分子基團(tuán)和結(jié)構(gòu)更有利于與膽酸鹽絡(luò)合，使膽酸鹽排出體外，打斷膽肝循環(huán)，從而產(chǎn)生降血脂的功效。

結(jié)合LPA-P及其純化組分的結(jié)構(gòu)特性，可推測(cè)含有高硫酸基含量、巖藻糖和半乳糖含量的多糖，具有更強(qiáng)的膽酸鹽吸附能力及抗氧化活性。

3 結(jié) 論

對(duì)檸檬酸提取海帶多糖進(jìn)行脫蛋白和透析除鹽后得到一種多糖LPA-P，用DEAE離子交換柱分離純化得到3 種多糖組分LPA-P1、LPA-P2、LPA-P3。LPA-P、LPA-P1、LPA-P2、LPA-P3的平均分子質(zhì)量分別為20.13、17.55、28.71、17.14 kD，都含有硫酸基，且LPA-P3最多，LPA-P1最少。海帶多糖及其純化組分的單糖組成均以巖藻糖、半乳糖和甘露糖為主，LPA-P和LPA-P3主要的單糖為半乳糖，而LPA-P1和LPA-P2主要的單糖為甘露糖，LPA-P3的巖藻糖含量最高。海帶多糖的ABTS+·清除能力從大到小依次為L(zhǎng)PA-P3＞LPA-P＞LPA-P2＞LPA-P1，LPA-P3具有最強(qiáng)的膽酸鹽吸附能力，LPA-P和LPA-P2次之且無(wú)顯著性差異，而LPA-P1基本不具有膽酸鹽吸附能力。

[1] 黃宗國(guó). 中國(guó)海洋生物種類與分布[M]. 北京: 海洋出版社, 1994: 156-157.

[2] 武文潔.海帶綜合利用研究[J].食品科技, 2006, 31(1): 49-52. DOI:10.3969/j.issn.1005-9989.2006.01.016.

[3] 吳鳳娜, 張玲. 海帶多糖及其提取方法[J]. 山東食品發(fā)酵, 2011(3): 36-38.

[4] KIM K H, KIM Y W, KIM H B, et al. Anti-apoptotic activity of laminarin polysaccharides and their enzymatically hydrolyzed oligosaccharides from Laminaria japonica[J]. Biotechnology Letters, 2006, 28(6): 439-446.

[5] 彭波, 許實(shí)波, 許東暉, 等. 褐藻多糖硫酸酯的抗凝和纖溶活性[J]. 中草藥, 2001, 32(11): 1015-1018. DOI:10.3321/ j.issn:0253-2670.2001.11.026.

[6] 王庭欣, 王庭祥, 龐佳宏. 海帶多糖降血糖,血脂作用的研究[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2007, 29(1): 99-100.

[7] 樊文樂(lè). 海帶的綜合利用研究[D]. 天津: 天津科技大學(xué), 2006: 34.

[8] 鄧雪, 黃惠華. 茶花水溶性蛋白的分離純化及其體外吸附膽酸鹽能力的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2013, 29(1): 63-67.

[9] 賀繼東, 夏文水, 張家驪. 殼聚糖吸附膽酸鹽的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(2): 80-83.

[10] 吳雁, 王亦農(nóng), 馬建標(biāo). 水溶性殼聚糖降血脂作用的化學(xué)機(jī)理(Ⅰ):水溶性殼聚糖及其衍生物對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力研究[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 25(4): 757-761.

[11] 許安邦, 林維宣, 佟邵芳, 等. 食品分析[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 1994: 177-180.

[12] 盧茳虹, 林宗毅, 崔春, 等. 響應(yīng)面優(yōu)化檸檬酸提取海帶抗氧化多糖的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(15): 224-228.

[13] 盧茳虹, 林宗毅, 崔春, 等. 檸檬酸提取海帶渣中多糖及其抗氧化活性與結(jié)構(gòu)的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(23): 93-96.

[14] ZHAO X, XUE C H, LI Z J, et al. Antioxidant and hepatoprotective activities of low molecular weight sulfate polysaccharide from Laminaria japonica[J]. Journal of Applied Phycology, 2004, 16(2): 111-115.

[15] SAHA S, NAVID M H, BANDYOPADHYAY S S, et al. Sulfated polysaccharides from Laminaria angustata: structural features and in vitro antiviral activities[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(1): 123-130. DOI:10.1016/j.carbpol.2011.07.026.

[16] NAVARINI L, GILLI R, GOMBAC V, et al. Polysaccharides from hot water extracts of roasted Coffea arabica beans: isolation and characterization[J]. Carbohydrate Polymers, 1999, 40(1): 71-81. DOI:10.1016/S0144-8617(99)00032-6.

[17] 叢建波, 王長(zhǎng)振, 李妍, 等. 褐藻硫酸多糖硫酸基含量測(cè)定: 硫酸鋇比濁法研究[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2003(3): 181-183.

[18] LIN L Z, ZHUANG M Z, ZOU L W, et al. Structural characteristics of water-soluble polysaccharides from Rabdosia serra (MAXIM.) HARA leaf and stem and their antioxidant capacities[J]. Food Chemistry, 2012, 135(2): 730-737. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.05.029.

[19] HUANG W Y, MAJUMDER K, WU J P. Oxygen radical absorbance capacity of peptides from egg white protein ovotransferrin and their interaction with phytochemicals[J]. Food Chemistry, 2010, 123(3): 635-641. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.04.083.

[20] ALMAJANO M P, DELGADO M E, GORDON M H. Changes in the antioxidant properties of protein solutions in the presence of epigallocatechin gallate[J]. Food Chemistry, 2007, 101(1): 126-130. DOI:10.1016/j.foodchem.2006.01.009.

[21] 周小理, 黃琳, 周一鳴. 苦蕎水溶性蛋白體外吸附膽酸鹽能力的研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(23): 77-81.

[22] YE S H, LIU F, WANG J H, et al. Antioxidant activities of an exopolysaccharide isolated and purified from marine Pseudomonas PF-6[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(1): 764-770. DOI:10.1016/ j.carbpol.2011.08.057.

[23] WANG J, ZHANG Q B, ZHANG Z S, et al. Antioxidant activity of sulfated polysaccharide fractions extracted from Laminaria japonica[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2008, 42(2): 127-132. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2007.10.003.

[24] PATANKAR M S, OEHNINGER S, BARNETT T, et al. A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities[J]. Journal of Biological Chemistry, 1993, 268(29): 21770-21776.

[25] XUE C H, FANG Y, LIN H, et al. Chemical characters and antioxidative properties of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica[J]. Journal of Applied Phycology, 2001, 13(1): 67-70.

Bile Salt Adsorption Capacity and Antioxidant Activity of Polysaccharide Extract from Laminaria japonica and Its Fractions

WANG Zhirong, CUI Chun*, LIN Zongyi, HUANG Junwei
(School of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Polysaccharide from Laminaria japonica (LPA-P) was isolated by using aqueous citric acid solution. After the removal of protein and salt, LPA-P was purified by DEAE Sepharose fast flow chromatography to obtain LPA-P1, LPA-P2, and LPA-P3. The respective relationships of bile salt adsorption capacity and antioxidant activity with molecular weight, sulfated group content and monosaccharide composition for LPA-P and its fractions were investigated. The results indicated that all LPA-P and its purified fractions contained sulfated group. LPA-P3 had the highest sulfated group content of 5.36%, while LPA-P1 had the lowest of only 1.22%. The major monosaccharide composition consisted of fucose, galactose and mannose. Galactose was the major monosaccharide in both LPA-P and LPA-P3, whereas mannose dominated the monosaccharide composition of both LPA-P1 and LPA-P2. LPA-P3 was the highest in fucose. The average molecular weights of LPA-P, LPA-P1, LPA-P2 and LPA-P3 were estimated to be 20.13, 17.55, 28.71, and 17.14 kD, respectively. LPA-P3 exhibited the strongest antioxidant capacity but LPA-P1 the weakest; the antioxidant capacity of LPA-P was a little stronger than that of LPA-P2. LPA-P3 had the strongest bile salt adsorption capacity, followed by LPA-P and LPA-P2. LPA-P1 had substantially no bile salt adsorption capacity. According to the structure-activity relationship of polysacchrides from Laminaria japonica, it is speculated that the higher the contents of sulfated group as well as fucose and galactose, the stronger bile salt adsorption capacity and antioxidant activity of the polysaccharides.

Laminaria japonica; polysaccharides; bile salt adsorption capacity; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201601005

TS201.1

A

1002-6630（2016）01-0022-06

王智榮, 崔春, 林宗毅, 等. 海帶多糖及其純化組分的膽酸鹽吸附能力及抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 22-27.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601005. http://www.spkx.net.cn

WANG Zhirong, CUI Chun, LIN Zongyi, et al. Bile salt adsorption capacity and antioxidant activity of polysaccharide extract from Laminaria japonica and its fractions[J]. Food Science, 2016, 37(1): 22-27. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601005. http://www.spkx.net.cn

2015-03-11

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2014AA093602）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014ZZ0053）

王智榮（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：W-Zhirong520@163.com

*通信作者：崔春（1978—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：cuichun@scut.edu.cn