氯胺酮對(duì)鼠大腦皮層離體神經(jīng)元氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)分泌的影響

孔祥星，郭岑，李欣然，師銘咸，高利

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科教研室，黑龍江哈爾濱150030）

氯胺酮對(duì)鼠大腦皮層離體神經(jīng)元氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)分泌的影響

孔祥星，郭岑，李欣然，師銘咸，高利

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科教研室，黑龍江哈爾濱150030）

為研究氯胺酮對(duì)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，明確其中樞作用機(jī)制，為今后科學(xué)合理用藥提供依據(jù)，試驗(yàn)將Wistar大鼠大腦皮層神經(jīng)元進(jìn)行離體培養(yǎng)，在培養(yǎng)第7天加入1 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL氯胺酮，分別在加藥后0、5、10、15、20、25、30、45、60、90、120 min取上清液40 μL檢測(cè)Glu、Asp、Gly和GABA的含量。不同劑量氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)元后Asp都顯著升高，Gly和GABA都顯著降低，且3 μg/mL和5 μg/mL氯胺酮作用效果明顯，而1 μg/mL作用后Glu的含量升高，3 μg/mL、5 μg/mL卻降低。結(jié)果表明氯胺酮直接作用于神經(jīng)元后，通過抑制興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)Glu和Asp的合成和分泌及增強(qiáng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)Gly和GABA的釋放來達(dá)到麻醉作用。且氯胺酮的麻醉作用強(qiáng)弱與劑量大小有一定的相關(guān)性。

氯胺酮；Wistar大鼠；神經(jīng)細(xì)胞；天冬氨酸；γ-氨基丁酸

氯胺酮作為動(dòng)物臨床常用靜脈麻醉藥物，良好的鎮(zhèn)痛作用，作為分離麻醉劑，氯胺酮能夠選擇性地作用于大腦的聯(lián)絡(luò)經(jīng)路和丘腦-新皮層系統(tǒng)，表現(xiàn)為疼痛與意識(shí)的分離現(xiàn)象。氯胺酮很少單獨(dú)應(yīng)用，多數(shù)用于基礎(chǔ)麻醉或與其他藥物復(fù)合麻醉，來減少麻醉藥的用量，降低其毒副作用，并提高麻醉效果，擴(kuò)大安全范圍。

近年來，關(guān)于氯胺酮對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響的研究一直是臨床研究的熱點(diǎn)，目前普遍認(rèn)為氯胺酮產(chǎn)生麻醉作用機(jī)制是它與NMDA受體有關(guān)，氯胺酮可以調(diào)節(jié)突觸后受體的神經(jīng)傳遞，作為一種非競(jìng)爭(zhēng)性的拮抗劑，氯胺酮會(huì)阻斷NMDA受體并引起分離麻醉［2］。而氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）和γ-氨基丁酸（GABA）是中樞重要的一類小分子神經(jīng)遞質(zhì)，在大腦中，Glu和Asp介導(dǎo)了大部分的興奮性突觸傳遞過程，而Gly和GABA作用正好相反。關(guān)于氯胺酮對(duì)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)影響及影響程度沒見相關(guān)報(bào)道，為此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)鼠大腦體外培養(yǎng)神經(jīng)元給予氯胺酮，檢測(cè)其氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)分泌及分泌情況進(jìn)行分析，研究其中樞作用機(jī)制，為今后科學(xué)合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1試驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠50只，體重200±20 g，雌雄兼用，孕16～18 d Wistar大鼠3只，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2主要試驗(yàn)試劑鹽酸氯胺酮注射液：沈陽(yáng)市獸藥廠，20100701，甘氨酸（Gly）標(biāo)準(zhǔn)品，L-谷氨酸（L-Glu）標(biāo)準(zhǔn)品，天冬氨酸（Asp）標(biāo)準(zhǔn)品，γ-氨基丁酸（GABA）標(biāo)準(zhǔn)品，由美國(guó)Sigma公司提供。

1.3試驗(yàn)器械Waters 600高效液相色譜儀，色譜柱：美國(guó)Waters公司生產(chǎn)，Symmetry C18（4.6× 150 mm，5 μm）Column；XBridge BEH Amide XP Column（2.1×100 mm，1.7 μm）；細(xì)胞培養(yǎng)箱，細(xì)胞培養(yǎng)板，氮吹儀，離心機(jī)，微量移液器，高速冷凍離心機(jī)，液氮罐，漩渦振蕩器，真空抽濾器，PH計(jì)，超聲波清洗器等。

2試驗(yàn)方法

在神經(jīng)元培養(yǎng)前1 d進(jìn)行包被培養(yǎng)板，在紫外線下，培養(yǎng)板照射30 min，加入足量的聚左旋賴氨酸來覆蓋底部，微微傾斜搖動(dòng)，放入培養(yǎng)箱中包被過夜，確保聚左旋賴氨酸在孵育期完全覆蓋培養(yǎng)板底部。

試驗(yàn)時(shí)將Wistar大鼠斷頸處死，常規(guī)手術(shù)消毒，開腹，從子宮中取出胎鼠后，處死，頭部置于平皿中，用鑷子壓住兩邊，輕輕分離頭部皮膚，鑷子壓住一側(cè)，使用精細(xì)手術(shù)剪，制造大腦基部切口，切開頭蓋骨，分離并除去兩側(cè)頭蓋骨，在除去頭蓋骨時(shí)，盡量避免碰觸大腦組織，用鑷子從底部夾斷大腦，轉(zhuǎn)移到含有分離培養(yǎng)基的10 mL燒杯中，確保大腦完全浸在分離培養(yǎng)基（97.5 mLHBSS加入1 mL丙酮酸鈉、0.5 mL葡萄糖、1 mLHEPES）中。在解剖鏡下取的大腦皮質(zhì)，用眼科剪將腦組織剪碎置于15 mL離心管中，沉底后留下5～10%液體，再加10 mL的分離培養(yǎng)基，待組織沉底后輕柔地洗2次，加入0.5 mL的胰酶，輕輕地渦旋混勻，37℃水浴鍋中消化5～10 min，，棄去液體，用5～10 mL的分離培養(yǎng)基洗2次，用1 mL槍頭，小心地吹打組織8～10次，確保分散細(xì)胞，獲得細(xì)胞懸液，取10 μL分散后的細(xì)胞，加90 μL的維持培養(yǎng)基（含96 mL Neurobasal medium加入2 mL B-27、1 mL Gluta MAX?、1 mL青鏈霉素）在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上估算活性細(xì)胞的密度，取10 μL分散后的細(xì)胞，加90 μL的維持培養(yǎng)基在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上估算活性細(xì)胞的密度，活性細(xì)胞可以通過平滑有光澤的性狀來鑒定，死的細(xì)胞則較暗，在6孔板上接種105～106個(gè)/mL細(xì)胞，慢慢混勻確保接種到培養(yǎng)板上，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h，棄去原培養(yǎng)液，6孔板每個(gè)孔添加2 mL的37℃的維持培養(yǎng)液，5%CO2，37℃下培養(yǎng)，24～48 h后加入阿糖胞苷，神經(jīng)元的維持生長(zhǎng)，一周兩次，從孔中抽出一半的培養(yǎng)液，用新的37℃維持培養(yǎng)基代替，不要換全部的培養(yǎng)液，神經(jīng)元分泌因子可以促進(jìn)生長(zhǎng)和存活。

神經(jīng)元的鑒定方法：將多聚甲醛/蔗糖混合物加熱至37℃，利于保持神經(jīng)元形態(tài)。再?gòu)暮虚L(zhǎng)有神經(jīng)元玻片的孔中，把培養(yǎng)液緩慢吸出，迅速將1mL的多聚甲醛/蔗糖混合液，小心地加入到孔中以確保神經(jīng)突不被損壞，置于室溫10 min。棄去多聚甲醛/蔗糖混合物，加1 mL的0.1%（v/v）TritonX-100溶液到孔中，置于室溫10 min。用PBS再次輕柔沖洗玻片，加1 mL的5%（wt/v）牛血清白蛋白或10%血清，置于室溫1 h。加MAP2到玻片，4℃過夜。PBS沖洗玻片3次，加二抗置于室溫1 h，PBS沖洗玻片3次。在一側(cè)，加一滴抗褪色封固液，小心翻轉(zhuǎn)玻片，有細(xì)胞一面向下，在封固液那一面之上，從玻片邊緣，緩慢移除過量的封固液，確保玻片不會(huì)在上面移動(dòng)，保持神經(jīng)元形態(tài)損壞完整，載玻片放置在暗處1h，密封玻片邊緣。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)第7天加入1 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL氯胺酮，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，分別在加藥的0、5、10、15、20、25、30、45、60、90、120 min取上清液40 μL于EP管中，按照試劑盒的方法利用液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

原始數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel 2003進(jìn)行預(yù)處理并匯總。將預(yù)處理得到的數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行一維方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“-X±SD”方式表示；兩變量間簡(jiǎn)單相關(guān)分析采用直線相關(guān)回歸分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。應(yīng)用Microsoft Excel 2003制圖。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1神經(jīng)元培養(yǎng)結(jié)果連續(xù)8 d在相差顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化：剛?cè)〔墨@得的神經(jīng)元呈圓形，體積小，透亮，散在分布，種植后3 h細(xì)胞開始貼壁；培養(yǎng)4 d后，細(xì)胞明顯增大，許多細(xì)胞從胞體長(zhǎng)出多個(gè)突起，呈現(xiàn)椎形或星形。此時(shí)的神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的形態(tài)特征，神經(jīng)元胞體清晰明亮，呈明顯突起狀，與鄰近細(xì)胞突起可以形成接觸；8 d后神經(jīng)元胞體增大，細(xì)胞核明顯，突起進(jìn)一步增多并逐漸成網(wǎng)，細(xì)胞間出現(xiàn)互相遷移靠攏，部分神經(jīng)元聚集成團(tuán)，可見密集的神經(jīng)元細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，未見明顯的膠質(zhì)細(xì)胞。

大腦皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)至8 d時(shí)，進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，激光共聚焦顯微鏡下可見培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元被MAP2染色，原代培養(yǎng)物中富含神經(jīng)元、突起走形清楚、形態(tài)良好、核大而清晰、神經(jīng)元所占比例高。

3.2不同濃度氯胺酮對(duì)氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的影響

如圖1、2、3、4所示，1 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后，Glu的含量在10 min、15 min較對(duì)照組分別升高了35%、44%，差異極顯著（P＜0.05）。Asp的含量10 min較對(duì)照組升高了39%，差異極顯著（P＜0.01）。Gly的含量45 min較對(duì)照組升高了35%，差異顯著（P＜0.05）。GABA的含量10 min、15 min、20 min較對(duì)照組分別降低了35%、36%、35%，差異極顯著（P＜0.01）；而60 min、90 min較對(duì)照組分別升高了32%、37%，差異極顯著（P＜0.01）。

圖1不同濃度氯胺酮作用下Glu含量變化

圖2不同濃度氯胺酮作用下Asp含量變化

圖3不同濃度氯胺酮作用下Gly含量變化

圖4不同濃度氯胺酮作用下GABA含量變化

3 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后，Glu的含量60min較對(duì)照組降低了24%，差異極顯著（P＜0.01）。Asp的含量15、20、25、60、90 min較對(duì)照組分別升高59%、41%、37%、44%、46%，差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）。Gly的含量10 min較對(duì)照組降低了28%，差異極顯著（P＜0.01）。GABA的含量10、15、20、25 min較對(duì)照組分別降低了52%、58%、43%、23%，差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）；而60 min、90 min較對(duì)照組分別升高了30%、54%，差異極顯著（P＜0.01）。

5 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后，Glu的含量10 min較對(duì)照組升高了20%，差異顯著（P＜0.05）；Glu的含量25、30、45、60 min較對(duì)照組分別降低了20%、26%、33%、22%，差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）。Asp的含量10 min較對(duì)照組升高了45%，差異極顯著（P＜0.01）。Gly的含量10 min較對(duì)照組降低了25%，差異顯著（P＜0.05）。GABA的含量10 min、15 min、20 min較對(duì)照組分別降低了28%、22%、13%，差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）；而45 min、60 min、90 min較對(duì)照組分別升高了19%、32%、27%，差異極顯著（P＜0.01）。

4討論

已有的研究報(bào)道證實(shí)全麻藥能顯著增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取Glu的能力［3］。且均可使突觸前膜Glu釋放和攝取減少，提示抑制Glu釋放和攝取可能是全麻藥物作用的重要機(jī)制。正常情況下，Glu在谷氨酸能神經(jīng)元內(nèi)被攝取、聚集、儲(chǔ)存于囊泡內(nèi)，當(dāng)神經(jīng)元去極化時(shí)，囊泡內(nèi)的Glu以Ca2+依賴方式釋放于突觸間隙中，與突觸后不同亞型的Glu受體結(jié)合，完成興奮性突觸傳遞及其他生理作用［4］。

目前氯胺酮的作用機(jī)制研究主要集中于在NMDA受體上［5］。關(guān)于神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)報(bào)道較少，特別氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的作用過程還不是十分明確，預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，給大鼠腹腔注射氯胺酮后，大鼠先呈現(xiàn)興奮狀態(tài)，后逐漸進(jìn)入麻醉狀態(tài)，此行為學(xué)變化與離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中神經(jīng)遞質(zhì)的變化相符，通過查閱文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)有國(guó)內(nèi)學(xué)者［9］對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，于各時(shí)期取腦組織檢測(cè)Glu和Asp的含量后發(fā)現(xiàn)，在翻正反射消失期及深睡期兩種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)均呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，這可能是由于分離腦組織過程需要消耗大量時(shí)間，錯(cuò)過了短暫的興奮期。此外，任家順等研究了氯胺酮對(duì)缺血再灌注腦組織興奮性氨基酸遞質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)氯胺酮能明顯升高缺血再灌注期Glu和Asp含量［6］。為了證實(shí)氯胺酮是否也存在這種作用，本實(shí)驗(yàn)直接通過培養(yǎng)Wistar鼠大腦皮層離體神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后，興奮性氨基酸Glu和Asp的濃度均在短時(shí)間內(nèi)升高，然后逐漸降低，最后恢復(fù)至接近正常水平，且高濃度的氯胺酮作用更明顯。離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中神經(jīng)遞質(zhì)在氯胺酮作用下的變化與報(bào)道和我們?cè)隗w實(shí)驗(yàn)行為學(xué)變化相符，表明氯胺酮確實(shí)是通過對(duì)興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)Glu和Asp的抑制實(shí)現(xiàn)麻醉作用的。

國(guó)外有學(xué)者為了研究氯胺酮對(duì)大鼠皮質(zhì)及海馬Glu釋放的影響，將葡萄糖進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的葡萄糖主要在神經(jīng)元的檸檬酸循環(huán)中代謝分解，標(biāo)記的谷氨酸和GABA由星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放及攝取［5］。在此基礎(chǔ)上通過對(duì)在小鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)中，使用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)NMDA激活電流，Orser等觀察到氯胺酮會(huì)通過兩種機(jī)制來抑制NMDA受體，首先，它阻斷了開放的通道從而減少通道的平均開放時(shí)間，其次，通過變構(gòu)作用與閉合的受體相結(jié)合來減少通道的開放頻率。低濃度的氯胺酮主要作用于閉合通道的阻斷，高濃度的氯胺酮對(duì)開放和閉合通道都會(huì)起到一定的作用。這種雙向作用可能會(huì)導(dǎo)致Glu分泌抑制，這可能是本次高濃度氯胺酮測(cè)定Glu發(fā)現(xiàn)其降低原因，該文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果。

如果氯胺酮單純對(duì)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)作用，而對(duì)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)沒有作用的話，不可能產(chǎn)生良好的麻醉作用。

目前，氯胺酮與GABAA受體的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議。有研究表明，氯胺酮的麻醉作用主要通過增加GABA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的含量而產(chǎn)生的［7］，氯胺酮在臨床濃度下可增強(qiáng)GABA介導(dǎo)的抑制性突觸后電流，在爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的GABAA受體，氯胺酮可刺激GABA引起的氯電流，提示氯胺酮可能對(duì)GABAA受體有作用［8］。L氨基酸脫氫酶（GABA合成抑制劑）對(duì)氯胺酮產(chǎn)生的麻醉作用沒有影響，提示氯胺酮不是通過突觸前途徑增強(qiáng)GABAA能神經(jīng)傳遞，或不是通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的間接效能產(chǎn)生作用［9］。甘氨酸則是腦干和脊做突觸后的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，由甘氨酸激發(fā)的Cl-通道具有與GABA相似的傳導(dǎo)特性，大多數(shù)全麻藥對(duì)GABAA受體有顯著的增強(qiáng)作用。基于此，實(shí)驗(yàn)也測(cè)定了抑制性神經(jīng)遞質(zhì)Gly和GABA，發(fā)現(xiàn)麻醉濃度的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后，抑制性氨基酸Gly和GABA的濃度均在短時(shí)間內(nèi)降低，然后逐漸升高，最后恢復(fù)至接近正常水平，且高濃度的氯胺酮作用更明顯，與興奮性氨基酸不同的是，氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后，抑制性氨基酸呈現(xiàn)了完全相反的變化趨勢(shì)。

5結(jié)論

麻醉濃度的氯胺酮直接作用于神經(jīng)細(xì)胞后，通過抑制興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)Glu和Asp的合成和分泌及增強(qiáng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)Gly和GABA的釋放來達(dá)到麻醉作用。且氯胺酮的麻醉作用強(qiáng)弱與劑量大小有一定的相關(guān)性。

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Effects of Ketamineon theNeurocyteCulturein vitro in Fetal Rat

KONG Xiang-xing，GUO Cen，LI Xin-ran，SHI Ming-xian，Gao Li
（Institute of Animal Medicine Surgery Teaching and Research Section，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

To study the effects of ketamine on amino acid neurotransmitters and to clarify the mechanism of central nervous system，the Wistar rat cortical neurons were cultured in vitro with the addition of，1 μg/mL，3 μg/mL，5 μg/mL ketamine in the seventh day. Supernatant was couecred for the detection of the content of Glu，Asp，Gly and GABA，after 0，5，10，15，20，25，30，45，60，90 and 120 min.The results showed that Asp increased significantly at different doses of ketamine，and Glu and GABA were significantly lower. 3 μg/mL and 5 μg/mL ketamine had obvious effects，F(xiàn)urther more，Glu content was increased after the addition of 1 μg/mL ketamine. The results showed that ketamine acted directly on nerve cells by inhibiting excitatory amino acid neurotransmitter synthesis and secretion of Glu and Asp and enhancied the inhibitory neurotransmitter GABA Gly and release to achieve a narcotic effect.These data suggest that there is an association between the anesthesia activty of ketamine and the doses used.

Ketamine；Wistarrat；nerve cell；Asp；GABA

GAO Li

S859.791

A

0529-6005（2016）08-0101-04

2016-01-07

國(guó)家自然科學(xué)基金（31372491，31572580），黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃指導(dǎo)項(xiàng)目（201510224032）

孔祥星（1995-），女，本科生，就讀于基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)專業(yè)，E-mail：875228859@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com