羊駝呼吸系統疾病病例病原分析

覃勇，陶立，馬春霞，李軍，蒙振畝，

蘭美益2，3，韋志鋒2，3，陳澤祥2，3，楊威2，3

（1.百色市動物疫病預防控制中心，廣西百色533000；2.廣西獸醫研究所，廣西南寧5300012；3.廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，廣西南寧530001）

羊駝呼吸系統疾病病例病原分析

覃勇1，陶立2，3，馬春霞2，3，李軍2，3，蒙振畝1，

蘭美益2，3，韋志鋒2，3，陳澤祥2，3，楊威2，3

（1.百色市動物疫病預防控制中心，廣西百色533000；2.廣西獸醫研究所，廣西南寧5300012；3.廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，廣西南寧530001）

羊駝產于南美洲，是歸屬于偶蹄目駱駝科的一種野生動物，外形與綿羊有些相似，體重在55～65 Kg之間。由于羊駝的毛比一般羊毛更長，且更光亮和富有彈性，是高級毛織物的原材料，具有很高的經濟價值，此外，羊駝外形憨厚，形態可愛，常被動物園作為觀賞動物飼養。我國于2002年首次引進，并組建了繁育基地，現全國各地都有小規模的養殖，由于羊駝是外來品種，國內養殖歷史短，在繁育問題解決的基礎上，隨之而來的是對羊駝疾病的認識和防控是羊駝養殖業將面臨的主要問題。

2014年11月廣西百色第五屆園博園動物展館飼養的4只6月齡羊駝，1只因流涕和嚴重呼吸困難等癥狀于次日死于欄舍內，為查明羊駝的死亡原因，筆者通過現場流行病學調查、臨床剖檢、病原分離鑒定與藥敏試驗，對病例病原進行分析，并據此提出綜合防制措施指導防控，病情沒有擴散，收到較好效果，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料及試驗動物病死羊駝肝臟、肺臟組織。20 g左右昆明系小鼠，購自廣西醫科大學實驗動物中心。綿羊肺炎支原體（Movi）、絲狀支原體山羊亞種（Mmc）和多殺性巴氏桿菌陽性分離株由廣西獸醫研究所細菌研究室分離鑒定保存。1.2試劑及儀器兔血瓊脂平板由廣西獸醫研究所細菌研究室制備，TSA、TSB、麥康凱瓊脂培養基，購自北京陸橋生物技術有限責任公司；PPLO肉湯，購自杭州百思生物技術有限公司；微量生化反應管及藥敏試紙，購自杭州天和微生物制劑有限公司。病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增、克隆所用試劑，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；低溫臺式高速離心機，購自Beckman公司；YY2Ⅲ-8B穩壓穩流型電泳儀，購自北京六一儀器廠；Pro Flex PCR System，購自Life Tech公司；721BR09310型凝膠成像系統，購自Bio-Rad公司；CO2培養箱，購自Thermo forma公司。

1.3方法

1.3.1臨床癥狀與剖檢病理觀察現場了解發病經過，臨床癥狀，剖檢病死羊駝，肉眼觀察記錄各臟器形態。

1.3.2細菌的分離鑒定將肺和肝組織制作組織觸片，固定，革蘭染色，鏡檢觀察；無菌取肺組織、肝組織分別劃線接種兔血瓊脂培養基平板、TSA平板，置37℃含5%CO2培養箱中培養24～48 h后觀察細菌生長，取疑似菌落進一步鑒定。

1.3.2.1病原細菌分離株致病性試驗將純化的細菌分離株接種TSB液，用其24 h培養液進行小鼠致病性試驗，試驗組5只小鼠每只均腹腔接種0.4 mL（菌液濃度為2×109CFU/mL）菌懸液，對照組5只小鼠腹腔接種等量的TSB液作對照。

1.3.2.2病原細菌分離株的生化試驗將病原細菌分離株經純化后按照文獻［1］的方法進行。

1.3.2.3細菌分離株16S rRNA基因PCR鑒定將分離純化培養的單個菌落溶解到10 μL滅菌的生理鹽水中，充分震蕩混勻，取3 μL菌液作為模板利用細菌16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增，反應體系為50 μL：模板3 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，2×Taq PCR Master Mix 26 μL，ddH2O補至50 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，72℃終延伸10 min。擴增產物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2.4藥敏試驗和治療藥敏試驗采用藥敏試紙法，方法按秦若甫［2］等報道的方法進行，根據藥敏試驗結果對羊駝群采取相應治療措施。

1.3.3支原體的分離鑒定無菌采取發病羊駝肺組織少許于研缽中剪碎，加適量PPLO支原體培養液充分研磨，4 000 r/min離心10 min，取上清液經0.45 μm一次性針式濾器過濾，將濾液按1∶10倍比稀釋接種于PPLO支原體培養液中，倍比稀釋的管數為10-1～10-5，置37℃含5%CO2培養箱中培養5～7 h、并連傳3代觀察培養液有無顏色變化。部分上清液作支原體PCR特異性檢測，特異性引物見表1。

表1PCR擴增特異性引物名稱和序列

1.3.4流感病毒的PCR檢測取肺組織進行勻漿后，反復凍融3次，4 000 r/min離心5 min，取上清液，按照病毒基因組RNA/DNA共提試劑盒說明書，抽提肺組織上清液的病毒基因組RNA，然后進行反轉錄與PCR反擴增。擴增產物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果

2.1臨床癥狀與病理變化2014年8月從深圳某羊駝訓養場購進4只約6月齡羊駝，經隔離檢疫合格后于9月對觀眾開放，并一直按原飼養方式飼養。11月3日發現1只羊駝精神狀態欠佳，食欲減退，呼吸急促，鼻流清涕，嘴角流有少量白色泡沫，少動，喜臥，有輕微拉稀，飼養員按說明劑量投喂利巴韋林和清開靈顆粒，4日早上發現該羊駝死在欄舍內。

剖檢發現腹腔和胸腔均有少量黃色清亮積液，肺部出血、肝變，切開有白色或粉紅色泡沫，氣管內充滿大量白色泡沫，肺門淋巴結腫大、出血，心臟血液凝固不良，肝臟呈暗紅色，膽囊腫脹充盈，胃內有大量草料、玉米顆粒、水樣混合物，胃液pH值為4，胃黏膜脫落，胃底呈片狀潰爛，十二指腸、大腸呈卡他性炎癥，其他臟器沒有肉眼可見病理變化。另外3只羊駝均未見病癥。

2.2細菌的分離鑒定結果

2.2.1肝、肺組織觸片染色鏡檢發現，肺組織中有革蘭陰性的小桿菌，肝組織中未發現。

2.2.2從肺組織分離到1株革蘭陰性小桿狀或球桿狀菌，該菌在TSA平板上生長良好，可生成圓形、灰色濕潤、光滑致密、邊緣整齊的菌落，在血平板上呈β溶血，在麥康凱培養基上菌落為圓形，凸起、茶色的小菌落，在TSB液中培養24 h均勻混濁。

2.2.3細菌分離株小鼠致病性試驗結果接種分離菌后24～48 h，試驗組小鼠全部死亡，死亡小鼠肺出血，肝腫大、出血，并從小鼠的肺肝中回收到接種菌。對照組小鼠無異常。

2.2.4分離菌株生化結果分離株不分解碳水化合物，M.R.、V-P和吲哚試驗陰性，觸酶、硝酸鹽和尿素陽性，符合支氣管敗血波氏桿菌的生化特征（表2）［3］。

表2分離株生化特性試驗結果

2.2.5分離菌株16S rRNA基因PCR鑒定結果PCR擴增獲得約1 400 bp的目的片段（見圖1）。將PCR產物經膠回收后送測序，測序結果與GenBank上登錄的支氣管敗血波氏桿菌CLR2013-1株（登錄號：KM079614）的核苷酸序列同源性達到98%，測序結果表明，病原菌為支氣管敗血波氏桿菌。2.2.6分離菌株的藥敏試驗藥敏結果顯示，分離菌株對阿奇霉素、氧氟沙星、強力霉素等11種抗菌藥物敏感；對先鋒V、利福平等7種抗菌藥物耐藥（表3）。

圖1細菌16S rRNA PCR擴增結果

表3分離菌株藥敏試驗結果

2.3支原體的分離鑒定結果支原體的分離培養連傳3代，PPLO支原體培養液未見顏色發生變化，說明沒有支原體生長。但3種羊支原體特異性基因片段PCR檢測結果發現綿羊肺炎支原體呈陽性見圖2、圖3。

圖2Movi PCR擴增結果

圖3Mmc Mccp PCR擴增結果

2.4流感PCR檢測結果陰性。

2.5治療措施清掃整個欄舍，糞便堆積發酵處理，并用百毒殺消毒整個欄舍及其周邊環境。選用高敏感藥阿奇霉素對3只羊駝連續用藥3～5 d，同時，加強管理，添加多維和微量元素，適當增加精料以提高抗應激和抗病的能力，3只羊駝未見發病。

3討論

3.1從發病經過、臨床癥狀與病理變化、病原分離鑒定等方法對病例病原進行分析，結果表明，從病死羊駝的肺組織中分離得1株革蘭陰性的致病桿菌。從該菌的生化特性和16S rRNA基因PCR擴增測序檢測結果表明，該致病菌是支氣管敗血波氏桿菌。用3種羊支原體和流感病毒的特異性PCR診斷引物對病死羊駝的肺組織進行檢測，發現綿羊肺炎支原體為陽性，而絲狀支原體山羊亞種、山羊支原體山羊肺炎亞種和流感病毒為陰性。采用支氣管敗血波氏桿菌和支原體高敏藥物阿奇霉素對同欄的3只羊駝進行預防，未見發生新的病例。病原分析和藥物治療的結果證實引起本例羊駝呼吸道疾病病原有支氣管敗血波氏桿菌、綿羊肺炎支原體。

3.2綿羊肺炎支原體是引起山羊和綿羊支原體肺炎的重要病原之一，可導致山羊和綿羊肺的嚴重出血和肺間質增生，在國內山羊和綿羊感染帶菌現象非常普遍，該病原菌可經空氣傳播。有資料表明，綿羊肺炎支原體除感染山羊和綿羊外，還可感染小反芻獸如麝牛、大角羊等［6-7］，但未見感染羊駝的報道，至于綿羊肺炎支原體是否可引起羊駝的感染發病，還有待于動物回歸致病試驗。

3.3支原體體外培養條件要求苛刻，培養成功相對困難，這次用PPLO支原體培養基連續3次傳代培養均為陰性，這可能與未及時送檢有很大的關系。

［1］白文彬，于康震.動物傳染病診斷學［M］.北京：中國農業出版社，2002：84-96.

［2］秦若甫，李智紅，韋志鋒，等.二株綿羊肺炎支原體藥物敏感性試驗和臨床治療體會［J］.廣西畜牧獸醫，2011，27（3）：165-166.

［3］陸承平.獸醫微生物學［M］.4版.北京：中國農業出版社. 2008：158-160.

［4］Goodnow R A.Biology of Bordetella bronchiseptica［J］.Microbiolgy Reviews，1980，44（4）：722-738.

［5］裴潔，何華，趙戰勤，等.支氣管敗血波氏桿菌的研究進展［J］.畜牧獸醫科技信息，2006，2：4-6.

［6］Handeland K，Tengs T，Kokotovic B，et al.Mycoplasma ovipneumoniae-a primary cause of severe pneumonia epizootics in the Norwegian Muskox（Ovibos moschatus）population［J］.PLoS One，2014，9（9）：e106116.

［7］Besser T E，Cassirer E F，Potter K A，et al.Epizootic pneumonia of bighorn sheep following experimental exposure to Mycoplasma ovipneumoniae［J］.PLoS One，2014，9（10）：e110039.

S829.9

B

0529-6005（2016）08-0049-03

2015-05-29

廣西壯族自治區水產畜牧局科研項目（桂漁牧科072411，桂漁牧科08283-2）

覃勇（1974-），男，獸醫師，本科，研究方向為動物疫病防控，E-mail：bsshouyi@163.com

陶立（1964-），男，高級獸醫師，本科，研究方向為從事動物疫病的防制和研究，E-mail：gxlitao1223@163.com

注：陶立與覃勇對本文具有同等貢獻

李軍，E-mail：Jlee9981@163.com；楊威，E-mail：gxyangwei@163.com