長白山梅花鹿鹿茸干細胞S100A4基因克隆及原核表達

張宇航，郝景鋒，薛會明，劉健博，蘭文峰，李心慰，劉國文

（1.吉林農業(yè)科技學院動物科技學院，吉林吉林132000；2.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春130062）

長白山梅花鹿鹿茸干細胞S100A4基因克隆及原核表達

張宇航1，郝景鋒1，薛會明1，劉健博1，蘭文峰1，李心慰2，劉國文2

（1.吉林農業(yè)科技學院動物科技學院，吉林吉林132000；2.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春130062）

為了研究S100A4蛋白在鹿茸發(fā)生過程中的生物學功能，構建長白山梅花鹿鹿茸S100A4基因原核表達載體，并進行BL21原核表達；自鹿茸骨膜中提取總RNA，逆轉錄成cDNA，以特異性引物擴增S100A4，擴增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體并測序鑒定，將目的片段和原核表達質粒pET-15b分別用BamH I和HindⅢ雙酶切并連接，再將重組質粒轉入BL21用TPIG進行誘導表達；結果通過序列的對比分析，S100A4基因是一個相對保守的基因，與多個物種的匹配度達到90%，與牛S100A4基因同源性最高，達到98.4%；成功構建了pET15b-S100A4表達質粒，轉化BL21誘導表達后，SDSPAGE電泳檢測顯示表達的蛋白分子量為11 kD，與預期一致。表明梅花鹿鹿茸干細胞S100A4基因的可以在原核中克隆、分析和表達，為真核表達和進一步的蛋白功能分析奠定了基礎。

梅花鹿；S100A4基因；克隆；原核表達

S100蛋白家族是一類EF-手型鈣結合蛋白，是一類廣泛存在的鈣調蛋白，通過鈣離子信號傳導途徑參與細胞分裂、分化、腫瘤生長以及細胞外基質分泌活動等過程［1］。S100A4蛋白是由101個氨基酸組成的多肽，在多種腫瘤細胞中高表達，而且惡性腫瘤中比良性腫瘤中表達更高，在正常成年器官和組織中不表達，目前的研究確定S100A4蛋白是一個與惡性腫瘤密切相關的因子［2］。

鹿茸是一個良好的生物醫(yī)學模型，雄性梅花鹿頭部生茸區(qū)骨膜細胞（AP細胞）每年周期性形成角柄，AP細胞中S100A4蛋白呈現(xiàn)高表達，而AP細胞分化成角柄骨膜細胞（PP細胞）進而快速形成鹿茸過程中，PP組織及PP細胞都不表達S100A4基因，也檢測不到S100A4蛋白，表明S100A4蛋白主要參與角柄形成過程，而且經(jīng)歷了從高表達到不表達的轉變，但其生物學功能及調控機制目前還不清楚［3-4］。本試驗擬擴增梅花鹿S100A4基因序列，并克隆到pET-15b質粒中，利用大腸埃希菌BL21進行表達，為研究S100A4蛋白在鹿茸生長過程中的作用機制奠定基礎，為腫瘤發(fā)生機制的研究提供思路。

1材料與方法

1.1材料RNA提取、反轉錄及PCR試劑、限制性內切酶（BamH I，HindⅢ）、T4 DNA連接酶、質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司；pMD18-T載體、pET-15b載體（Clontech公司）；LB培養(yǎng)基自制；BL21菌株、DH5-α菌株為本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1S100A4基因的擴增、鑒定采集雄性梅花鹿AP組織，液氮冷凍，研磨，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉錄成cDNA，根據(jù)牛S100A4的cDNA序列（GenBank：D89056.1）設計引物，序列如下：F：5′-TACTCGGGCAAGGAGGG-3′，R：5′-GCCAGGGTGAGCTGATG-3′，預測片段長度：330 bp，電泳后切膠，以試劑盒回收330左右的目的片段，回收產(chǎn)物連接于pMD18-T載體，轉化DH5-α，測序鑒定。

1.2.2序列分析用DNAman軟件及GenBank在線Blast工具對克隆的梅花鹿S100A4序列進行分析，并與GenBank中已登錄的牛、犬、豬、羊、鼠、人基因進行同源性比較。

1.2.3載體構建、轉化及原核表達將克隆質粒pMD18-S100A4，及pET-15b載體分別用BamH I、HindⅢ雙酶切，分別回收純化后以T4連接酶4℃過夜連接，構建pET15b-S100A4質粒，轉化大腸埃希菌BL21，涂布于瓊脂平板（含Kan 30 μg/mL），37℃倒置培養(yǎng)18 h，挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)后提取質粒用BamH I、HindⅢ雙酶切鑒定。將酶切鑒定正確的pET15b-S100A4轉化BL21，菌液加入100倍體積的LB液體培養(yǎng)基（含Kan 30 μg/mL），振蕩培養(yǎng)至吸光度（A）值0.4～0.6，加入誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，試驗設pET-15b空質粒誘導對照和BL21誘導對照，收集菌液提取總蛋白，SDSPAGE電泳檢測表達產(chǎn)物。

2結果

2.1梅花鹿S100A4基因的擴增、測序及同源性分析以梅花鹿AP細胞DNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到330 bp清晰條帶，如圖1，與預期基本一致。回收后連接于pMD18-T載體，轉化DH5-α，測序鑒定后利用DNAman軟件分析發(fā)現(xiàn)與人、牛、羊、鼠、犬、豬同源性分別達到91.3%、98.4%、 92.5%、85.6%、88.6%、95.2%。

圖1S100A4基因擴增結果

2.2載體構建結果以BamH I、HindⅢ雙酶切pMD18-S100A4，得到約330 bp的片段，以相同內切酶處理pET-15b質粒，再將330 bp的片段與其連接，得到pET15b-S100A4。酶切鑒定如圖2。

2.3原核表達結果pET15b-S100A4轉化BL21感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導后蛋白表達量超過30%，SDS-PAGE電泳檢測顯示蛋白分子質量為11 kD，與預期基本一致，如圖3。

圖2重組質粒酶切鑒定

圖3S100A4基因表達產(chǎn)物的檢測

3討論

鹿茸每年可進行周期性再生，生茸區(qū)骨膜AP組織和細胞中都有S100A4蛋白的表達，而每年的基礎角柄骨膜PP組織和細胞中都檢測不到S100A4蛋白，表明鹿茸形成過程中S100A4蛋白經(jīng)歷了一個從表達到不表達的轉變。本試驗克隆了長白山梅花鹿的S100A4基因，通過DNAman軟件及在線Blast發(fā)現(xiàn)，該基因與牛、豬、人的S100A4基因具有非常高的重合度，說明這是一個非常保守的基因，鑒于S100A4在癌變組織中也呈現(xiàn)高表達，現(xiàn)階段研究S100A4蛋白對鹿茸生長的影響及調控機制，對揭示器官快速生長與癌變的關系，對腫瘤的預防和治療有著重要的意義，以鹿茸作為模型研究癌變是一全新思路，而S100A4的生物學功能是建立這一生物模型的關鍵。

S100A4基因從表達到沉默的機制目前尚不清楚，其生物學功能在腫瘤研究領域初現(xiàn)端倪，F(xiàn)ernandez等研究發(fā)現(xiàn)，S100A4蛋白過度表達，會使細胞周期失去控制，促進腫瘤的發(fā)生［5］；Sherbet G V等研究發(fā)現(xiàn)，S100A4蛋白可以和細胞骨架發(fā)生作用，增強細胞的變形能力，從而增加腫瘤細胞的活動能力［6-7］；Ambartsumian N等在試驗中發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白可以作為血管生成因子對血管形成直接起作用，而在腫瘤生長和轉移的過程中，血管發(fā)生是關鍵環(huán)節(jié)［8-9］。在鹿茸生長發(fā)育特別是角柄形成過程中，AP細胞快速增殖階段，大量表達的S100A4蛋白是否也與細胞轉移或血管形成有關尚待證實，在角柄形成以后，PP細胞形成鹿茸階段，同樣需要細胞轉移和血管生成，但S100A4在這一時期卻沒有表達，所以對S100A4的研究才剛剛開始，本試驗構建了S100A4基因的原核表達載體并在BL21中表達，為研究該蛋白在鹿茸生長中的作用奠定了基礎。

［1］王大濤，趙海平，褚文輝，等.梅花鹿S100A4基因的克隆及融合蛋白的表達［J］.獸類學報，2011，31（1）：103-107.

［2］張英，李莉，郝琳琳，等.梅花鹿S100A4基因的克隆及原核表達［J］.中國病原生物學雜志，2013，8（3）：242-244.

［3］劉東.梅花鹿鹿茸干細胞S100A4融合蛋白在大腸桿菌中的表達與純化［D］.鎮(zhèn)江：江蘇科技大學，2011.

［4］魏明立，褚文輝，趙海平，等.梅花鹿S100A4基因RNAi重組慢病毒載體的構建［J］.獸類學報，2012，32（4）：335-339.

［5］Fernandez-Fernandez M R，Veprintsev D B，F(xiàn)ersht A R.Proteins of the S100 family regulate the oligomerization of p53 tumor suppressor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：4735-4740.

［6］Sherbet G V，Lakshmi M S.S100A4（MTS1）calcium binding protein in cancer growth，invasion and metastasis［J］.Anticancer Res，1998，8（4A）：2415-2421.

［7］Kimura K，Endo Y，Yonemura Y，et al.Clinical significance of S100A4 and E-cadherin-related adhesion molecules in nonsmall cell lung cancer［J］.Int J Oncol，2000，16（6）：1125-1131.［8］Ambartsumian N，Grigorian M，Lukanidin E.Genetically modified mouse models to study the role of metastasis-promoting S100A4（mts1）protein in metastatic mammary cancer［J］.J Dairy Res，2005，72（S1）：27-33.

［9］Schmidt-Hansen B，Ornas D，Grigorian M，et al.Extracellular S100A4（mts1）stimulates invasive growth ofmouse endothelial cells andmodulates MMP-13 matrix metalloproteinase activity［J］. Oncogene，2004，23（32）：5487-5495.

S865.42

A

0529-6005（2016）08-0043-02

2015-03-06

吉林農業(yè)科技學院重點實驗室培育項目（吉農院合字2013第S034號）

張宇航（1981-），男，講師，博士生，從事臨床獸醫(yī)學方向研究，E-mail：zyh7680@163.com

郝景鋒（1977-），男，講師，博士生，從事臨床獸醫(yī)學教學及研究，E-mail：jlhjf2012@163.com

注：郝景鋒與張宇航對本文具有同等貢獻

劉國文，E-mail：gwliu@jlu.edu.cn；李心慰，E-mail：lixinwei100@126.com