豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清6型PCR方法的建立及初步應用

李海利，徐引弟，朱文豪，張青嫻，游一，郎利敏，王克領，張立憲，侯自花

（河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南鄭州450002）

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清6型PCR方法的建立及初步應用

李海利，徐引弟，朱文豪，張青嫻，游一，郎利敏，王克領，張立憲，侯自花

（河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南鄭州450002）

為了建立豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清6型分子鑒定方法，本研究根據胸膜肺炎放線桿菌從編碼莢膜多糖的堿基序列設計1對引物，擴增特異性的720 bp核酸片段。結果表明，以APP為模板，均能擴增出與預期一致的1條720 bp核酸片段，所得PCR產物經測序，與GenBank已發表的胸膜肺炎放線桿菌血清型6型的同源性達99%以上。本研究建立了PCR檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清6型分子鑒定方法，該方法的建立為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌病的診斷和防治及鑒定提供了基礎。

豬傳染性胸膜肺炎；放線桿菌；血清6型

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的豬的一種高度接觸性致死性的呼吸道傳染病，居于呼吸道疾病的首位［1］。世界各地均有發生，以歐、美州、中國等各國流行［2-3］。本病的主要臨床特征為纖維素性肺炎、出血性肺炎、壞死性肺炎、胸腔積液、心包炎等，多成最急性或急性病程而迅速致死。各種年齡的豬只均可感染，以斷奶豬和育成豬多發。規模化和集約化豬場，一旦發生本病很難徹底根除和凈化，給養殖戶造成重大的經濟損失［4］。進年來，世界各地均加強了呼吸道疾病的防控措施，尤其是對APP的研究，在病原學、流行病學、血清學、診斷、疫苗和免疫預防等方面均取得了較大的進展。根據APP在生長過程中是否需要輔酶Ⅰ，將APP分為依賴生長因子NAD的生物Ⅰ型和不依賴生長因子NAD的生物Ⅱ型，Ⅰ型比Ⅱ型毒力強。Ⅰ型又分為12個血清型，其中5型又分為a、b兩個亞型，Ⅱ型有2個血清型。各個血清型之間無交叉保護或有很弱的交叉保護。各個血清型都可引起發病，但不同血清型的毒力有明顯差異。臨床中1、3、5、6、9和11六種血清型毒力最強，發病率也較高，常常引起較高的死亡率和嚴重的經濟損失［5-8］。本試驗對APP血清6型PCR程序和分子鑒定進行了研究，為APP的分子血清型診斷、流行病學調查及防控提供依據。

1材料與方法

1.1DNA回收試劑盒，TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、2×Buffer、NAD等，購自寶生物工程（大連）有限公司。APPⅠ型至12型陽性血清，購自中國獸醫藥品監察所。腦心浸液瓊脂（含10%犢牛血清和100 μg/mL NAD），購自青島海博生物技術有限公司。

1.2菌株把臨床分離保存的菌株從-80℃的冰箱中取出，用75%酒精脫脂棉球擦凈安培瓶，用火焰加熱器頂端，滴少量無菌水使之破裂，用無菌鑷子敲下已破裂的頂端。接種于腦心浸液瓊脂（含10%犢牛血清和100 μg/mL NAD）平板上，置于體積分數為5%CO2培養箱中培養24 h，提取單菌落進行純化培養。

1.3細菌血清型鑒定取純培養的細菌，制備適宜濃度的細菌菌懸液，與不同血清型APP標準陽性血清進行平板凝集試驗，觀察凝集現象，確定分離菌的血清型。

1.4PCR分子鑒定（1）APP基因組提取及模板制備：將胸膜肺炎放線桿菌接種于腦心浸液瓊脂（含10%犢牛血清和100 μg/mL NAD）平板上，置于體積分數為10%CO2培養箱中培養24 h，按細菌基因組提取試劑盒（LifeFeng Cat#DK622-01）進行DNA的提取；（2）PCR引物：從編碼莢膜多糖的堿基序列設計引物。上游引物5′-AGTATGGCAATCAGTCGATTCAT-3′，下游引物3′-CGTAATCGGAAACGCCATTCTC-5′。預期擴增片段為720 bp；（3）PCR反應條件的優化：①最適模板用量的確立：分別以5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ng DNA為模板，進行PCR擴增反應，確定最佳的模板用量；②最適引物用量的確立：在50 μL PCR反應體系中分別加入不同用量的引物，上下游引物（25 pmol/μL）分別加0.5、0.7、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 μL，進行PCR擴增反應，確定最佳的引物用量；③最適退火溫度的確立：PCR反應的退火溫度分別取50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60℃，進行PCR擴增反應，確定最佳的退火溫度；（3）PCR擴增反應條件：根據上面試驗確定的最適模板用量為30 ng 0.5 μL，最適引物用量為1.4 μL（25 pmol/μL），最適退火溫度為56℃，確定的PCR反應體系為：反應總體積為50 μL，無菌超純水37.2 μL，2×Buffer（Mg+）5.0 μL，dNTPS 4.0 μL（2.5 mmol/μL），上游引物1.4 μL（25 pmol/μL），下游引物1.4 μL（25 pmol/μL），Taq enzyme 0.5 μL（5 U/μL），模板0.5μL。PCR擴增程序為：95℃預變性3 min，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，32個循環，最后72℃延伸10 min；（4）PCR擴增產物的檢測及回收：取5 μL擴增產物和5 μL Loading Buffer混勻，加到含EB的1.5%的瓊脂糖凝膠中，120 V，電泳25 min，在凝膠成像儀中觀察（圖1）。用（UNIQ-10）柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）回收胸膜肺炎放線桿菌PCR擴增產物；（5）PCR產物的連接：將回收的PCR產物分別與pUCm-T載體按T-載體PCR產物克隆試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）方法連接；（6）大腸桿菌感受態細胞的制備、連接產物的轉化及藍白斑篩選：應用一步法制備高效感受態細胞試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）方法操作；（7）質粒DNA的提取、酶切鑒定及陽性克隆測序：按照質粒DNA提取試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）進行操作，將上一步酶切鑒定的陽性克隆重組質粒，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。用Applied Biosystems（3730XL）測序儀測序。

1.5臨床應用應用本試驗建立的PCR檢測方法供檢測臨床送檢的疑似分離病料18份，對陽性擴增產物進行序列測定。

2結果與分析

2.1細菌血清型菌株的純培養物分別與Ⅰ型～12型APP標準陽性血清進行平板凝集試驗，結果發現，分離到的15株菌均與標準6型陽性血清呈現明顯的凝集現象，與其他標準陽性血清和生理鹽水對照均不發生凝集反應。凝集試驗結果表明，分離到的15株菌均為胸膜肺炎放線桿菌血清6型。

2.2PCR產物的檢測、克隆及測序PCR產物經凝膠電泳，然后在凝膠成像儀中觀察（圖1）。

圖1豬胸膜肺炎放線桿菌PCR產物電泳結果

從圖1可以看出，以APP為模板，均能擴增出與預期一致的1條720 bp核酸片段，而豬肺炎支原體沒有擴增出該片段。

所得PCR產物經測序，與GenBank已發表的胸膜肺炎放線桿菌血清型6型的同源性達99%以上。

2.3臨床應用應用本研究建立的PCR檢測方法檢測臨床送檢的疑似分離病料16份，結果顯示，檢出的陽性樣品9份（圖2），將陽性樣品的PCR擴增產物克隆后序列分析顯示均為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌6型。

圖2臨床樣品檢測

3討論

PCP以突然發病、纖維素性肺炎、肺部出血、胸腔積液、局部肺部壞死和肺炎為主要特征。該病在豬群暴發后，引起豬只生長緩慢、飼料報酬降低等。目前，該病是引起豬呼吸道疾病最主要的疾病之一，給養豬業造成嚴重的經濟損失。用藥后，容易產生耐藥性，停藥后往往容易復發，帶菌豬會成為再次感染的傳染源。疫苗免疫是控制此病的首選，但APP血清型較多，各個血清型之間沒有或有較弱的交叉保護，這給本病的防控帶來了困難。并且每一個疫苗并不能保護所有的血清型。所以開展各個地區的流行病學調查，摸清各個地區的流行情況和主要血清型，制備適合當地的血清型疫苗，可以有效的預防和控制本病的傳播和流行。

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［2］Tobias T J，Klinkenberg D，Bouma A，et al.A cohort study on Actinobacillus pleuropneumoniae colonisation in suckling piglets［J］. Prev Vet Med，2014，114（3-4）：223-230.

［3］Yoo A N，Cha S B，Shin M K，et al.Serotypes and antimicrobial resistance patterns of the recent Korean Actinobacillus pleuropneumoniae isolates［J］.Vet Rec，2014，174（9）：223.

［4］Shin M K，Kang M L，Jung M H，et al.Induction of protective immune responses against challenge of Actinobacillus pleuropneumoniae by oral administration with Saccharomyces cerevisiae expressing Apx toxins in pigs［J］.Vet Immunol Immunopathol，2013，151（1-2）：132-139.

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Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype6 PCR program optimization and molecular identification

LI Hai-li，XU Yin-di，ZHU Wen-hao，ZHANG Qing-xian，YOU Yi，LANG Li-min，WANG Ke-ling，ZHANG Li-xian，HOU Zi-hua
（Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

In order to establish a method for the identification of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 6，a pair of primers was designed according to the APP from the nucleotide sequence encoding the capsular polysaccharide for the 720 bp amplification of 720 bp specific nucleic acid fragment.The results showed that the APP as a template，could be amplified in line with expectations of the 720 bp fragment.The PCR products were then sequenced，and had a homology of 99%with the sequences published in GenBank of APP serotype 6.The establishment of this method provides a basis for diagnosis and prevention and identification of porcine Actinobacillus pleuropneumoniae.

Porcine contagious pleuropneumonia；Actinobacillus pleuropneumoniae；Serotype 6

S852.61+9

A

0529-6005（2016）08-0038-02

2015-04-15

河南省農業科學院優秀青年科技基金（2013YQ22，河南省農業科學院自主創新基金（2015CX12）；河南省農業科學院博士科研啟動基金（2013BQ03）

李海利（1982-），男，助理研究員，博士，主要從事動物傳染病臨床診斷及防控研究工作，E-mail：haili8693@sina.com