安徽番鴨細小病毒的分離和PCR檢測

戴銀，張丹俊，沈學懷，趙瑞宏，胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學利

（安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，安徽合肥230031）

安徽番鴨細小病毒的分離和PCR檢測

戴銀，張丹俊，沈學懷，趙瑞宏，胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學利

（安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，安徽合肥230031）

為研究安徽省番鴨細小病毒遺傳變異狀況，通過番鴨胚接種分離了安徽流行株，并進行PCR檢測。將擴增基因序列AH-MDPV-1和AH-MDPV-2在NCBI數據庫中進行相似性搜索比對，結果顯示，兩者與番鴨細小病毒基因同源性均大于99%；與鵝細小病毒基因同源性分別介于79%～90%和78%～81%之間。進一步將AH-MDPV-1與7條參比的細小病毒基因序列進行比對，可見番鴨細小病毒的該部分基因相對較為保守，而與鵝細小病毒基因相應區域具有明顯差異，表明該基因特異性較強，可以作為番鴨細小病毒的鑒定依據。同時可判定該病毒分離株為番鴨細小病毒。

番鴨細小病毒；病毒分離；PCR檢測

番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒（Muscovy duck parvovlrus，MPV）引起的急性傳染病，主要侵害1-3周齡的雛番鴨，又稱3周病。病雛番鴨常表現為喘氣、消瘦、拒食、軟腳和腹瀉等主要臨床癥狀，剖檢可見消化道及小腸部位病變。該病具有高度的傳染性，其發病率較高，死亡率可達50%～80%；且少數病愈鴨生長緩慢，大多成為“僵鴨”［1-2］。番鴨細小病毒病最早由我國學者林世堂等發現，隨后國內外不斷有相關的研究報道［3-6］。目前，番鴨細小病毒病已是嚴重危害番鴨養殖業的主要疫病，我國多地雛番鴨大量死亡，造成了嚴重的經濟損失。近期安徽省部分番鴨群也發現了類似病癥，且呈現暴發的趨勢，為進一步研究番鴨細小病毒的流行發病趨勢和遺傳進化特征，更好地防控該病，我們采集了病料，并進行了病毒分離和PCR鑒定，以及初步的基因序列分析。

1材料與方法

1.1材料非免疫健康番鴨胚，購自非疫區；病料來源于安徽省某養鴨場，具明顯番鴨細小病毒病癥狀的番鴨。DNA提取試劑、Taq酶、dNTP等PCR試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設計經Oligo6.0軟件分析，參照GenBank數據庫中登錄的番鴨細小病毒基因序列（登錄號：KM093740），及已發表的文獻［7-8］，設計兩對特異性擴增引物。P-1：5′-AAGAGAAAGAAAACCCGT-3′，P-2：5′-GTTGCCTCCAAAGGAGGTA-3′；P-3：5′-TGTACCCTTCTATGGCTGTG-3′，P-4：5′-TTCTCCATATCATCAATAG-3′。兩個預期擴增片段大小分別為624 bp和900 bp。擴增的目的片段分別命名為AH-MDPV-1，AH-MDPV-2。引物

由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2病毒的分離取疑似番鴨細小病毒病病料組織研磨，經過處理制成濾過液接種12日齡番鴨胚，棄去24 h前死亡的胚胎，收集72～120 h之間死亡的胚胎尿囊液。

1.2.3基因組DNA的提取按常規方法提取總基因組DNA［8］。將尿囊液經5 000 r/min離心10 min，取上清，分別加入10%SDS至終濃度為2%，再加蛋白酶K至50 μg/mL，充分混勻，37℃水浴2 h后，用等量飽和酚抽提1次，再用等量飽和酚-氯仿抽提2次，用等體積氯仿抽提1次，加入1/10體積3 mol/L NaAC（pH值5.2）和2倍體積預冷的無水乙醇，16 000 r/min離心10 min，沉淀病毒核酸，TE（pH值8.0）溶解，-20℃保存備用。

1.2.4基因的擴增以提取的基因組DNA為模板，分別采用P1、P2和P3、P4為上下游引物，擴增基因AH-MDPV-1和AH-MDPV-2。PCR反應體系：10× PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加雙蒸水補足60 μL。按以下程序進行擴增：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1min，30個循環，72℃延伸10 min。擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.5基因序列分析測序后的基因序列在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）數據庫中進行相似性比對搜索，選擇番鴨和鵝細小病毒株（goose parvovirus，GPV）共7條參比序列作為分析樣本，登錄號分別為番鴨JF926695，鵝EF515837，番鴨U22967，番鴨KC171936，X75093，鵝EU5833 92，鵝U34761。使用Clustal X 1.83軟件比對序列，采用DNAStar、MegAlign等軟件分析各序列同源性。

2結果

2.1病毒的分離從接種病料的番鴨胚中分離出1株病毒，可見病變胚體發育受阻，全身出血，胸和背頭部均有充、出血點，尤以頭部出血更為嚴重，胚體死亡時間在3～7 d。

2.2基因組DNA的提取由電泳圖可見，所提取的兩個樣品基因組DNA在2 000 bp上方均有明顯的DNA條帶（圖1），雖然部分條帶有部分降解拖尾現象，但由于PCR的高敏感性，該模版完全能夠滿足后續試驗的要求。

2.3番鴨AH-MDPV基因的擴增以提取的基因組DNA為模板，P1、P2和P3、P4為引物PCR擴增，分別獲得了一條約600 bp和900 bp大小的特異性DNA片段（圖2），與預期目的片段大小相符。將擴增的基因產物純化、測序。測序結果與Gen-Bank中登錄的相應基因序列進行比對。

圖1基因組DNA電泳圖

圖2AH-MDPV基因的PCR擴增

2.4同源性分析將獲得的兩個基因序列AHMDPV-1和AH-MDPV-2分別在NCBI數據庫中進行相似性搜索比對，結果顯示，兩者與番鴨細小病毒基因同源性均大于99%；除個別鵝細小病毒基因序列外，AH-MDPV-1和AH-MDPV-2與鵝細小病毒同源性均相對較低，分別介于79%～90%和78%～81%之間。隨后從中選擇7條參比序列，與AH-MDPV-1進行比對（圖3）。可見與AHMDPV-1同源性最高的是來自于國內番鴨細小病毒株的基因序列KC171936，為99.8%，最低是鵝細小病毒株序列U34761。進一步序列分析可見番鴨細小病毒的該部分基因相對較為保守，僅有個別堿基發生突變，而與鵝細小病毒相應區域則差異顯著，表明該基因特異性較強，可以作為鑒定依據。因此，可判定該次分離的安徽病毒株為番鴨細小病毒。

3討論

3.1隨著番鴨養殖業的規模化發展，病毒的不斷更新變異，番鴨細小病毒已經成為危害世界番鴨養殖業較為嚴重的病毒之一［9］。本研究通過非免疫健康番鴨鴨胚分離了番鴨細小病毒，并進行PCR檢測，序列分析顯示，擴增序列AH-MDPV-1與鵝細小病毒相應序列差異明顯，證實為番鴨細小病毒基因組特異基因。同時可見AH-MDPV-1與所比較的番鴨細小病毒毒株的基因序列均大于99%，最高的是來自于國內番鴨細小病毒毒株的基因序列KC171936。研究結果表明，安徽流行的番鴨細小病毒毒株與國內的部分流行株同源性較高，可能來自于共同祖先，但主要毒力相關基因是否發生變異，還需要進一步深入研究。

3.2鵝細小病毒是小鵝瘟的烈性傳染病的病原，鵝細小病毒既能感染鵝又可以感染番鴨，同樣是危害極為嚴重的疫病之一。研究結果可見番鴨與鵝細小病毒毒株同源性總體相對較低，基因序列同源性僅介于82.1%～86.5%之間。但研究表明，鵝細小病毒與番鴨細小病毒的病毒形態結構、基因組、病理變化和臨床癥狀等方面較為相似，在實際生產中小鵝瘟雛鵝活疫苗和抗血清也能夠提高雛番鴨對MDPV的抵抗能力［7-8，10］。同時，有研究發現，鵝細小病毒和番鴨細小病毒與細小病毒屬其他成員特征差異較大，但卻與依賴病毒屬的腺聯病毒關系密切，他們可能來源于共同的祖先，且可能是自主細小病毒與依賴細小病毒進化的“聯接點”［11］。盡管鵝細小病毒與番鴨細小病毒有很多相似的特點，但感染的寄主卻有差異，說明兩者在抗原特征上存在差異。血清檢測也證實番鴨細小病毒與鵝細小病毒抗原差異性很大。接下來我們將進一步克隆獲得番鴨細小病毒非結構蛋白和結構蛋白的完整基因，深入研究其遺傳學特點、抗原性差異及病毒致病機理為該病的預防控制奠定基礎。

圖3基因序列分析

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［7］鮮思美，文心田，曹三杰，等.鵝細小病毒和番鴨細小病毒雙重PCR檢測方法的建立［J］.畜牧與獸醫，2010，42（4）：32-35.

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Separation and PCR Detections of Muscovy Duck Parvovirus in Anhui

DAI Yin，ZHANG Dan-jun，SHEN Xue-huai，ZHAO Rui-hong，HU Xiao-miao，HOU Hong-yan，PAN Xiao-cheng，ZHOU Xue-li
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei 230031，China）

To investigate the variation status of muscovy duck parvovirus in Anhui province，the Anhui epidemic strain was isolated from the muscovy duck embryo，and then was identified by PCR sequence analysis.The sequence similarity of AH-MDPV-1 and AH-MDPV-2 genes were analyzed，and the gene homology between Anhui strain and the other Muscovy duck parvoviruses all were 99%.However，the homology between both genes and genes of goose parvovirus ranged from 79%to 90%and from 78%to 81%，respectively.Alignment of AH-MDPV-1 and 7 gene sequences from NCBI database，the genes of Muscovy duck parvoviruses were relatively conservative，but obvious difference was observed between Muscovy duck parvoviruses and goose parvoviruses. The result indicated that AH-MDPV-1 was the specific gene of Muscovy duck parvovirus，and could be used for gene identification.

Muscovy duck parvovirus；Separation；PCR for detection

ZHANG Dan-jun

S852.65+9.2

A

0529-6005（2016）08-0035-03

2015-04-15

國家自然科學基金項目（31302044）；國家蛋雞產業技術體系項目（CARS-41）；安徽省現代農業肉禽產業發展資金項目和院科技創新團隊（11C0404）資助

戴銀（1980-），女，助理研究員，博士，主要從事獸醫微生物與免疫學研究，E-mail：daiyin2020@163.com

張丹俊，E-mail：zhangdj694@sina.com