雞α干擾素的原核表達及純化

吳斯宇，孫超，崔進，馮賽祥，黃健妮，王念晨，曲楠楠，廖明，焦培榮

（1.華南農業大學獸醫學院人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室農業部獸用疫苗創制重點實驗室廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東廣州510642；2.君拓價值投資公司，美國新澤西州08542；3.北京利昂盛生物技術有限公司，北京海淀100094）

雞α干擾素的原核表達及純化

吳斯宇1，孫超2，3，崔進1，馮賽祥1，黃健妮1，王念晨1，曲楠楠1，廖明1，焦培榮1

（1.華南農業大學獸醫學院人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室農業部獸用疫苗創制重點實驗室廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東廣州510642；2.君拓價值投資公司，美國新澤西州08542；3.北京利昂盛生物技術有限公司，北京海淀100094）

根據大腸桿菌密碼子的偏好性對GenBank中發表的雞α干擾素基因序列進行了密碼子優化，全基因合成了雞α干擾素基因片段486 bp。構建原核表達質粒pET-23b-ChIFN-α。將重組質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3），用IPTG進行誘導表達，表達產物主要以包涵體形式存在，包涵體進行變性、復性和鎳柱親和純化。表達產物經SDS-PAGE、Western-Blot分析表明，ChIFN-α蛋白得到了高效表達，其蛋白分子質量約19 kD，經鎳柱親和純化后獲得了高純度的重組雞α干擾素蛋白，其含量為0.82 mg/mL。本研究為雞α干擾素的生物學活性分析和臨床產品研發奠定了基礎。

雞α干擾素；原核表達；蛋白純化

根據大腸桿菌密碼子的偏好性對GenBank中發表的雞α干擾素基因序列進行密碼子優化，人工合成該雞干擾素基因。接著成功構建了雞α干擾素的原核表達質粒，經原核表達后獲得了雞α干擾素的重組蛋白。表達產物經SDS-PAGE、Western-Blot分析表明，本研究獲得了重組干擾素的高效表達，其蛋白分子質量約19 kD，經鎳柱親和純化后獲得了高純度的重組雞α干擾素蛋白，其含量約為0.82 mg/mL。這為雞α干擾素的生物活性分析與臨床開發應用奠定了基礎。

1材料與方法

1.1菌種E.coli/DH5α、BL21（DE3）由華南農業大學獸醫學院動物傳染病實驗室保存。

1.2質粒及相關酶pET-23b由華南農業大學獸醫學院動物傳染病實驗室保存。限制酶EcoRI、NdeI及T4 DNA連接酶等，購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA片段快速回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3雞α干擾素基因的克隆及密碼子的優化根據大腸桿菌密碼子的偏好性對GenBank中發表的雞α干擾素基因序列（AB021154）進行了密碼子優化，人工合成該雞α干擾素基因。優化后的基因由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

引物設計：根據密碼子優化后的雞α干擾素基因，利用Primer5.0軟件設計1對特異性的引物。

ChIFN-α-F：5′-TATATACATATGTGCAACCATCTGCGCCCG-3′，

ChIFN-α-R：5′-TATATAGAATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGTGCGGGTGTTGCCGG-3′。

1.4重組表達質粒的構建以人工合成的雞α干擾素基因為模板，以含NdeI酶切位點的ChIFN-α-F和含EcoRI酶切位點、His標簽的ChIFN-α-R的引物，雞α干擾素基因PCR產物經NdeI、EcoRI雙酶切克隆到原核表達載體pET-23b。重組陽性質粒送英濰捷基（上海）貿易有限公司測序鑒定。

1.5雞α干擾素基因在大腸桿菌中的表達將測序正確的pET-23b-ChIFN-α重組質粒轉化BL21（DE3）感受態細胞，經氨芐青霉素抗性平板篩選、NdeI、EcoRI雙酶切鑒定，進一步驗證該重組陽性質粒。將再次鑒定的pET-23b-ChIFN-α-BL21（DE3）接種于液體LB培養基，37℃震蕩培養。OD值為0.6時，培養物中加終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導表達。繼續培養4 h之后，離心收集菌體，通過SDS-PAGE方法分析目的蛋白的表達情況。

1.6雞α干擾素蛋白的純化

1.6.1包涵體的提取與處理將1L誘導表達的重組菌E.coli/pET-23b-ChIFN-α以10 000 r/min離心收集菌體，按1∶5的菌體超聲緩沖液（50 mmol/ L Tris，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，pH值7.0）重懸菌體，在冰浴的條件下，充分超聲破碎，然后于10 000 r/min（4℃）離心15 min收集沉淀（沉淀即為粗制包涵體）。

1.6.2包涵體的變性按1∶5的包涵體變性液比例將洗滌后的包涵體溶解于8 mol/L尿素的變性液中（50 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Uera，5 mmol/L DTT，pH值8.0）。室溫磁力攪拌6 h，然后以12 000 r/min（4℃）離心20 min，收集變性液上清，4℃保存。

1.6.3包涵體的復性采取梯度稀釋法進行蛋白復性，復性時采用滴管懸滴，分3次把變性液加入到預冷的復性液（50 mmol/L Tris-HCl，0.15 M Na-Cl，0.3 mol/L L-Arg，1 mM GSSG，5 mmol/L GSH， 10%甘油，pH值7.0）中，使變性液與復性液的比例達到1∶20。完成后轉入4℃冰箱，靜置復性24 h。

1.6.4鎳柱親和純化復性完成后，復性液經透析除去L-Arg，參照QIAGEN公司鎳柱純化說明書純化His標簽的目的蛋白進行。

1.6.5SDS-PAGE、Western-Blot檢測結果將SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉印至硝酸纖維素膜（NC），用His標簽抗體（1∶2 000）作為一抗，用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠（1∶10 000）作二抗，Western-Blot檢測目的蛋白。

2結果

2.1重組雞α干擾素表達質粒的構建挑取5個克隆進行菌落PCR篩選，菌落PCR篩選結果為陽性的質粒送英濰捷基公司測序鑒定。測序結果與優化的雞α干擾素的序列比對分析，表明成功構建重組雞α干擾素原核表達質粒。

圖1菌落PCR檢測

2.2重組雞α干擾素的誘導表達結果用IPTG對含有原核表達質粒pET-23b-ChIFN-α的BL21表達菌株進行誘導，誘導后的菌液經12%SDS-PAGE分析，結果顯示，表達的重組雞α干擾素蛋白的分子質量約19 kD，與預期結果相符，證明重組雞α干擾素表達正確。

圖2蛋白表達的SDS-PAGE檢測

圖3表達產物復性及純化的SDS-PAGE檢測

2.3重組雞α干擾素的復性、純化結果表達產物經過變性復性、透析、鎳柱親和純化后，對樣品進行SDS-PAGE分析，結果顯示，純化產物純度較高，蛋白濃度達0.82 mg/mL。

2.4重組雞α干擾素蛋白純化后Western-Blot驗證重組雞α干擾素蛋白經Western-Blot檢測在19 kD處出現目的條帶，表明表達產物為目的蛋白（如圖4）。

圖4雞α干擾素Western-Blot檢測

3討論

近年來我國養禽業發展迅速，規模不斷擴大。但是，禽流感、雞新城疫，雞傳染性支氣管炎等病毒類疾病的流行制約了養禽業發展的重要因素。目前我國仍然采用疫苗免疫、化學藥物及抗生素治療等方法來防制禽類疾病。但由于病原的血清型復雜、變異速度快，常常導致疫苗的免疫效果不佳，同時抗生素和化學藥物的使用又因為病原的耐藥性與藥物殘留問題而限制了其使用的范圍。家禽干擾素具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用，干擾素是由英國病毒生物學家Isaacs等于1957年在雞上發現并被命名的，1994年Sekellick等首次成功克隆和表達了雞α干擾素（chicken interferon-alpha，ChIFN-α）基因［1-2］。近年來國內外學者對禽干擾素的表達與抗病毒活性進行了研究。何靜等將雞α干擾素與白介素-18融合表達，獲得了具有抗新城疫病毒的重組干擾素蛋白［3］。戴華等通過原核表達獲得了在雞胚上具有抗高致病性禽流感H5N1的重組α干擾素蛋白［4］。龔浪等通過基因工程的方法獲得含有雞α干擾素的真核表達質粒［5］。蔡梅紅等通過酵母的表達系統獲得了具有抗馬立克病病毒和新城疫病毒的重組α干擾素，也通過大腸桿菌原核表達的方法獲得了具有抗傳染性支氣管炎病毒的重組雞β干擾素［6-7］。Reuter等人則是證明了雞λ干擾素具有抗病毒作用［8］。

本研究根據大腸桿菌密碼子的偏好性對Gen-Bank中發表的雞α干擾素基因序列進行了密碼子優化，人工合成該序列。構建了干擾素重組表達質粒pET-23b-IFN-α，經原核表達后獲得了雞α干擾素的重組蛋白。誘導、純化產物經SDSPAGE，Western-Blot驗證，結果顯示，pET-23b-IFN-α在大腸桿菌中表達良好，純化效果良好。本研究為雞干擾素生物學活性分析的研究及臨床開發應用的研制奠定了基礎。

［1］Isaacs A，Lindenmann J.Virus interference I.The interferon［J］. Proc R Soc Lond B Biol Sci，1957，147（927）：258-267.

［2］Sekellick M J，Ferranno A F，Hopkins D A，et al.Chicken interferon gene：cloning，expression，and analysis［J］.Interferon Res，1994，14（2）：71-79.

［3］何靜，張盼盼，孫敏華，等.雞α干擾素/白細胞介素18基因的融合表達及抗病毒活性研究［J］.華南農業大學學報，2015，36（01）：18-22.

［4］戴華，鄭佳玉，陳俊華，等.α干擾素基因的原核表達及其活性測定［J］.中國預防獸醫學報，2009，31（10）：804-807.

［5］龔浪，林宏文，崔進，等.雞α干擾素基因真核表達載體pCAGGS-IFN-α的構建及其在293 T細胞中的表達［J］.黑龍江畜牧獸醫，2014（15）：21-23+27+268.

［6］蔡梅紅，曹瑞兵，曹景立，等.重組酵母雞α干擾素的誘導表達及其抗MDV、NDV能力［J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），2010，38（09）：37-41.

［7］Cai Meihong，Zhu Feng，Shen Pingping，et al.Expression and purification of chicken beta interferon and its antivirus immunological activity［J］.Protein Expression and Purification，2012，84（1）：123-129.

［8］Reuter A，Soubles S，Hartle S，et al.Antiviral Activity of Lambda Interferon in Chickens［J］.Journal of Virology，2014，88（5）：2835-2843.

Prokaryotic expression and purification of recombinant chicken interferon-alpha

WU Si-yu1，SUN Chao2，3，
CUI Jin1，FENG Sai-xiang1，HUANG Jian-ni1，WANG Nian-chen1，QU Nan-nan1，LIAO Ming1，JIAO Pei-rong1（1.C
ollege of Veterinary Medicine，National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control，Key Laboratory of Animal Vaccine Development，Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Junto Value Investments，LLC，USA New Jersey，08542；3.Beijing Lioson Biotech Company Limited，Beijing 100094，China）

ChIFN-α gene secquence from Genebank was designed and synthesized based on the synonymous codon bias of E.coli，and GC-content was optimized.The ChIFN-α gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-23b and highly expressed in E.coli by 1 mM IPTG induction.Then recombinant protein in form of inclusion body was purified by nickel affinity chromatography after being denatured and re-natured.Analysis of objective protein by SDS-PAGE and Western blot showed that the objective band was 19 kD is clear and confirmed that ChIFN-α was expressed correctly and high purity recombinant ChIFN-α was obtained.This study laid a foundation for the study of biological activities of ChIFN-α.

ChIFN-α；prokaryotic expression；protein purification

s：JIAO Pei-rong；LIAO Ming

S816.75

A

0529-6005（2016）08-0029-03

2016-04-19

科技部國際合作項目（2013DFA31940）；廣州市科技計劃項目（2013J4500030、201300000037）

吳斯宇（1991-），男，碩士生，研究方向為動物傳染病學與免疫學，E-mail：15813365538@163.com

焦培榮，E-mail：prjiao@scau.edu.cn；廖明，E-mail：mliao@scau.edu.cn