FK506 雷帕霉素滴眼液對內毒素誘導的大鼠葡萄膜炎的療效觀察

趙佳佳　黃一飛?

·實驗研究·

FK506 雷帕霉素滴眼液對內毒素誘導的大鼠葡萄膜炎的療效觀察

趙佳佳黃一飛?

目的 觀察FK506和雷帕霉素滴眼液對內毒素誘導的大鼠葡萄膜炎的治療作用。方法 12只實驗大鼠隨機分為空白溶劑組、0.1%FK506組、0.2%雷帕霉素組，每組各4只，注射脂多糖24h開始分別滴空白溶劑、0.1%FK506、0.2%雷帕霉素滴眼液，4次/d裂隙燈觀察攝像，并參照Hoekzema的方法記錄臨床評分，并進行病理學觀察，比較用藥組與對照組的差異。結果 成功建立大鼠葡萄膜炎模型，0.1%FK506組、0.2%雷帕霉素組的眼部癥狀評分在注射后1～2d、7d與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3～6d與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），病理學觀察示0.1%FK506組、0.2%雷帕霉素組炎癥細胞浸潤明顯小于對照組組。結論 0.1%FK506、0.2%雷帕霉素滴眼液均可有效抑制SD大鼠葡萄膜炎的發(fā)展。

FK506 雷帕霉素 滴眼液 葡萄膜炎

葡萄膜炎是眼部主要免疫性疾病之一，目前免疫抑制劑FK506、雷帕霉素治療葡萄膜炎多為口服劑型［1-3］。FK506眼部局部使用治療葡萄膜炎多在研究階段，Whitcup等研究證實FK506脂質體滴眼液可以使內毒素誘導的葡萄膜炎的炎癥細胞浸潤明顯減少［4］，Keiko等研究證明玻璃體腔注射FK506可以有效抑制實驗性自身免疫性葡萄炎的發(fā)展［5］。雷帕霉素全身應用可以明顯抑制葡萄膜炎的進程［6］，與環(huán)孢霉素A或FK506聯(lián)用亦能抑制葡萄膜炎的進展，同時可減少藥物使用劑量［7-9］，但局部應用研究較少。2012年1月至6月作者通過建立內毒素誘導的大鼠葡萄膜炎模型，明確FK506和雷帕霉素滴眼液對葡萄膜炎的治療作用。

1　材料和方法

1.1材料 SD雄性大鼠，體重200～250g，SPF級，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，傷寒桿菌內毒素（美國sigma公司）；FK506由軍事醫(yī)學院制成滴眼液；雷帕霉素由軍事醫(yī)學院制成混懸滴眼液。裂隙燈顯微鏡（日本TOPCON公司），眼前節(jié)照相系統(tǒng)（日本TOPCON公司）。

1.2方法 （1）SD大鼠葡萄膜炎模型的建立：建立內毒素誘導的大鼠葡萄膜炎模型，將傷寒桿菌內毒素溶于生理鹽水制成濃度為2g/L的溶液，取100μl注射于SD大鼠雙后足底部［10］。于注射前及注射后第4h、12h、24 h、48h、7d進行裂隙燈檢查，出現(xiàn)陽性體征即表明模型成功建。（2）實驗分組：將12只SD大鼠隨機分成3組，A組：空白溶劑組；B組：0.1%FK506組；C組：0.2%雷帕霉素組；注射后24h開始點藥，6次/ d，持續(xù)注射7d。

1.3裂隙燈觀察 于注射后4h、12h、24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d進行裂隙燈檢查并攝像，參照Hoekzema［11］的方法對臨床表現(xiàn)進行評價與記分（見表1）。

表1　大鼠葡萄膜炎模型臨床評分標準

1.4病理學觀察 在注射脂多糖24h、4、7、11d后分別從每個組中取出一只大鼠處死后取整個眼球，在甲醛中固定24～36h，然后脫水，石蠟包埋，并進行連續(xù)切片（厚5μm），最后進行HE染色以進行病理學觀察。1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料用（x±s）表示，用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1癥狀體征觀察 SD大鼠注射傷寒桿菌內毒素后，4h可觀察到虹膜充血明顯，隨后出現(xiàn)房水閃輝，瞳孔縮小，前房滲出等葡萄膜炎表現(xiàn)，本次實驗中葡萄膜炎表現(xiàn)在24～48h達到最高峰，并于7d基本消退。

2.2病理學觀察 在注射脂多糖24h后處死大鼠并取整個眼球經瞳孔的矢狀切面進行病理切片，可見大鼠虹膜睫狀體明顯充血，有炎癥細胞如中性粒細胞、淋巴細胞的浸潤，角膜后可見沉著物，脈絡膜、及視乳頭周圍血管可見充血（見圖1）。

圖1　內毒素誘導的大鼠葡萄膜炎的病理學改變（注射脂多糖后24h）（×400）

2.3免疫抑制劑滴眼液抑制大鼠葡萄膜炎的觀察 注射脂多糖后每日通過裂隙燈下觀察各組大鼠眼部癥狀，根據(jù)癥狀進行評分。空白溶劑組、FK506組、雷帕霉素組均在注射脂多糖1d后，虹膜明顯充血，并可見房水閃輝、前房滲出，瞳孔中度縮小；3～4d后空白溶劑組可見虹膜充血減輕，房水閃輝、前房滲出仍可見，瞳孔極度縮小，而FK506組、雷帕霉素組可見房水閃輝減輕、前房滲出減少，瞳孔縮小，未出現(xiàn)極度縮小；空白溶劑組5～6d后可見虹膜充血減輕，房水閃輝減輕，瞳孔較前增大，而FK506組、雷帕霉素組則在4～5d虹膜充血減輕，房水閃輝減輕，瞳孔略小；空白溶劑組7～11d基本消退，前房滲出較多的仍可留有少量滲出，而FK506組、雷帕霉素組在5～7d基本消退。

2.4三組各時點大鼠葡萄膜炎臨床癥狀評分比較 見表2。

表2　三組各時間點眼部癥狀評分比較（x±s）

2.5免疫抑制劑滴眼液抑制大鼠葡萄膜炎的病理學觀察 各組在脂多糖注射24h，4、7、11d后取眼球進行切片行病理學觀察，可見虹膜、睫狀體有中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，房水中可見大量的蛋白滲出和中性粒細胞，脈絡膜、視網膜也可見中性粒細胞浸潤。雷帕霉素、FK506組的炎癥細胞的消退明顯快于空白溶劑組（見圖2）。

圖2　空白溶劑組、FK506組、雷帕霉素組的虹膜病理改變比較（×400）

3　討論

葡萄膜炎的發(fā)病機制及藥物療效的相關研究通常通過動物模型進行，目前有較多公認的動物模型，包括內毒素誘導的葡萄膜炎（EIU）、實驗性自身免疫性前葡萄膜炎（EAAU）、實驗性自身免疫性葡萄膜視網膜炎（EAU）。EIU是由細菌內毒素脂多糖誘發(fā)的嚴重的急性眼前節(jié)炎癥，可以代表急性前葡萄膜炎。本實驗研究免疫抑制劑滴眼液的藥效學，其作為一種局部治療，效果依賴于局部免疫反應機制，適合作為急性前葡萄膜炎的治療，因而本實驗選用代表前葡萄膜的EIU作為滴眼液的藥效學研究膜型。

內毒素或脂多糖是革蘭陰性菌的細胞壁成分，其可以在注射2h內破壞血-房水屏障，導致白細胞（大多數(shù)細胞為中性粒細胞）浸潤虹膜、睫狀小體和房水；結膜中有時也可見中性粒細胞的浸潤。本實驗誘導的EIU模型在脂多糖注射后24h，4、7、11d觀察到前葡萄膜包括虹膜、睫狀體均有中性粒細胞為主的白細胞浸潤，房水中可見大量的蛋白滲出和炎癥細胞，角膜后可見沉著物，同時脈絡膜、視網膜中可見血管充血及炎癥細胞浸潤。

雖然EIU中浸潤的細胞主要是中性粒細胞，T淋巴細胞也在其病理過程中起重要作用。Kogiso等在抗T淋巴細胞單克隆抗體處理后的鼠中再使用內毒素誘導葡萄膜炎，可見房水中的蛋白和浸潤的細胞均明顯減少，其中抗CD4抗體可以顯著抑制葡萄膜炎的進程，而抗CD8抗體則無此作用，因而T淋巴細胞及其釋放的細胞因子在EIU的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［12］。T淋巴細胞參與EIU的病理過程可能為炎癥反應使葡萄膜的抗原暴露，激活T細胞，初始CD4+T淋巴細胞在細胞因子IL-2、IL-12等的作用下分化為Th1細胞，Th1細胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α誘導產生細胞免疫［13］。而FK506通過抑制NF-AT進入細胞核內而抑制細胞因子如IL-2、TNF-α和IL-2受體的表達和轉錄［14］，從而可以阻斷葡萄膜炎的發(fā)生。而雷帕霉素/FKBP復合物通過抑制mTORC1而抑制IL-2與其受體結合后介導的T細胞的增殖和分化，初始T細胞不能分化為效應T細胞，因而雷帕霉素單用或聯(lián)合FK506或CSA可以通過抑制T細胞的增殖和分化而抑制葡萄膜炎的進程［15］。

本實驗通過制劑的調整使難溶于水的FK506、雷帕霉素能進入眼內發(fā)揮治療作用。日本研究所用的是FK506滴眼液中加入了蓖麻油、乙醇［16］。國內研制的FK506混懸滴眼液采用的是購自日本的FK506，并加入乙醇、Tween-80、聚乙烯氫、蓖麻油、羧甲基纖維素納、聚乙二醇、檸檬酸鈉、硫柳汞，并配置合適的濃度［17］。本實驗通過增溶劑制備可溶且穩(wěn)定的FK506滴眼液，該滴眼液pH值為7.0左右，滲透壓相當于0.9%氯化鈉溶液，同時加入增黏劑羧甲基纖維素納，未加防腐劑與抗氧化劑，需4°保存，可以減少硫柳汞等防腐劑的眼表毒性［18］。通過制劑的改變，F(xiàn)K506和雷帕霉素滴眼液可進入眼內發(fā)揮有效的治療作用，為尋找高效、安全的治療葡萄膜炎方法奠定基礎。

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Objective To study the effects of FK506 and Rapamycin eye drops in the treatment of endotoxin-induce uveitis in rats. Methods Twelve Sprague-Dawley（SD） rats were divided into three groups， which were 0.1% FK506 group（n=4）， 0.2% rapamycin group（n=4） and the control group（n=4）. After the injection of LPS for 24 hours， the above groups were given eye drops of 0.1%FK506， 0.2% rapamycin. The rats were observed by slit lamp microscope for 4 times per day and the symptom scores were recorded according to the methods provided by Hoekzema. Then the eyes were sampled for pathological observation.T test was used to analyze the data. Results The model of EIU in rats was successfully established. There were significant differences in the symptoms of EIU between 0.1%FK506 group and the control group， between 0.2% rapamycin group and the control group after the medication for 3-6 days（P＜0.05）. However， there were no signifi cant differences after the medication for 1-2 days（P＞0.05）. Pathological observation on the three grops showed that infl ammatory cell infi ltration in the 0.1% FK506 group and 0.2% rapamycin group alleviated. Conclusions Both 0.1% FK506 and 0.2% rapamycin eye drops can suppress the development of EIU in SD rats effectively.

FK506 Rapamycin Eye drops Uveitis

317500 浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院內分泌科（趙佳佳）

100853 解放軍總醫(yī)院眼科（黃一飛）