間接免疫熒光技術在內質網觀察實驗教學中的應用

王宏剛, 陳成彬, 王春國, 陳　力, 宋文芹, 白艷玲, 張金紅, 劉　方

(南開大學 生物實驗教學中心, 天津　300071)

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間接免疫熒光技術在內質網觀察實驗教學中的應用

王宏剛, 陳成彬, 王春國, 陳力, 宋文芹, 白艷玲, 張金紅, 劉方

(南開大學 生物實驗教學中心, 天津300071)

內質網的觀察實驗一直是“細胞生物學實驗”的經典教學內容,該實驗的教學主要采用活體染色的方式來開展。為了提高實驗教學的效果,將間接免疫熒光技術應用到該實驗的教學中。在實驗過程中,利用小鼠抗人鈣網蛋白的單克隆抗體和FITC標記的山羊抗小鼠的熒光二抗對廣泛存在于內質網上的鈣網蛋白進行標記,通過熒光顯微鏡觀察Hela細胞中內質網的基本形態和分布情況。將間接免疫熒光技術應用于內質網觀察實驗的教學中,可以讓學生掌握科研中常用的內質網標記技術,提高他們對科研工作的興趣,有助于培養他們的創新思維和科研綜合素質。

間接免疫熒光； 內質網； 實驗教學

內質網是一種非常重要的細胞器,擔負著細胞內合成蛋白質的重要作用[1]。目前,跟內質網相關的科學研究也非?；钴S[2-4]。對于生命科學及相關專業的本科生來說,內質網的結構和功能也是非常重要的知識點。內質網的顯微觀察一直是“細胞生物學實驗”的經典教學內容,在傳統的實驗教學中,主要采用活體染色的方式進行[5]。隨著實驗教學研究的深入,這種教學方式逐漸暴露出內容單一的缺點,不能適應現代實驗教學的需要。目前,將科研中常用的實驗技術應用到實驗教學是實驗教學改革的重要方向[6-9]。按照這一思路,我們采用科研中常用的內質網標記方法——間接免疫熒光法對內質網的觀察實驗進行改革,取得良好的教學效果,受到學生的歡迎。

1　實驗材料與試劑

1.1實驗材料

人宮頸癌細胞HeLa細胞系。

1.2主要試劑

DMEM培養基、小牛血清、雙抗、胰蛋白酶、PBS緩沖液、2%BSA (PBS緩沖液配制)、4%多聚甲醛、TritonX-100、小鼠抗人鈣網蛋白的單克隆抗體、FITC標記的山羊抗小鼠的熒光二抗、防熒光淬滅封片劑(含DAPI)。

2　實驗方法

(1) 實驗前一天選擇生長狀態良好的HeLa細胞制作細胞爬片。

(2) 在實驗當天取出培養皿中的DMEM培養基(含10%小牛血清、1%雙抗)。加入37 ℃預溫的PBS洗滌3次,每次5 min。吸去PBS,加入4%多聚甲醛溶液對細胞進行固定。

(3) 15 min后吸去多聚甲醛,加入用37 ℃預溫的0.1% TritonX-100處理5 min。

(4) 吸去TritonX-100,使用PBS洗滌3次,每次5 min。吸去PBS,用濾紙輕輕吸去片子上的液體,滴加20 μL 2%BSA封閉液,蓋上培養皿蓋,室溫下封閉15 min。

(5) 吸去封閉液,滴加20 μL 1∶200稀釋的小鼠抗人鈣網蛋白的單克隆抗體,蓋上一塊比細胞爬片略小的封口膜和培養皿蓋,37 ℃孵育20 min。

(6) 用PBS洗滌3次,每次5 min。用濾紙小心吸去片子上的液體,滴加20 μL 1∶500稀釋的FITC標記的山羊抗小鼠熒光二抗,蓋上封口膜和培養皿蓋,37 ℃孵育20 min。

(7) PBS洗滌3次,每次5 min。孵育結束后用蒸餾水洗滌片刻,將蓋片風干。

(8) 在干凈載玻片上滴加3 μL含有DAPI的防熒光淬滅劑,將長有細胞的蓋玻片從培養皿中取出,反扣于淬滅劑上。使用熒光顯微鏡觀察,并用冷CCD拍照。

3　實驗結果

通過熒光顯微鏡可以觀察到經紫外線激發后,被DAPI標記的細胞核發出藍色熒光；經藍光激發后,被FITC標記的內質網鈣網蛋白發出綠色熒光。在正常狀態下,HeLa細胞中內質網充滿整個細胞,并在細胞核周圍密度較高(見圖1)。

圖1　Hela細胞中內質網的分布(100×)

4　討論

4.1教學注意事項

(1) 在實驗材料的選擇上,建議選擇生長較快、對培養條件要求較低、貼壁生長的細胞系,以降低實驗材料準備的難度,提高實驗的教學效率。

(2) 需要注意細胞的生長狀態,狀態不好的細胞,其內質網的分布、結構等特點均會發生改變,會對實驗結果造成較大的影響。

4.2教學組織

(1) 本實驗中,抗體的稀釋倍數、用量和孵育時間可以根據課程的學時數進行調整,以求獲得最佳的實驗結果。

(2) 熒光顯微鏡的數量及學生使用熒光顯微鏡的熟練度都會對實驗造成較大的影響,如班級人數過多,可考慮分組進行實驗,每個組在進行抗體孵育時采用不同的時間,錯開使用熒光顯微鏡的時間。

4.3教學拓展

通過本實驗的學習,學生可以掌握使用間接免疫熒光法標記內質網的基本方法。在此技術上,可以拓展開設其他探究性的實驗內容。例如,可以通過對內質網的標記來觀察細胞周期中不同時期的內質網,可讓學生掌握細胞周期中內質網的變化情況。還可以選擇一些藥物對細胞進行處理,然后觀察藥物對細胞內質網的影響。

5　結語

細胞核與細胞器的相關知識一直是“細胞生物學實驗”的經典教學內容,在“細胞生物學實驗”的教學體系中占有重要的地位[5,10-11]。隨著教學改革的推進,傳統的實驗設計模式已經逐漸不能適用現代實驗教學的需求。如何對這些經典的實驗內容進行改造,使其重新煥發活力已經成為實驗教學改革的重要課題。本文以內質網觀察實驗為突破口,將科研中常用的實驗技術引入這些經典內容的教學過程,希望能夠借此培養學生對科學研究的興趣,提高學生的創新思維和綜合科研素質,為他們未來的發展奠定堅實的基礎[12-13]。

References)

[1] 翟中和,王喜忠,丁明孝,等.細胞生物學 [M].4版.北京:高等教育出版社,2011.

[2] 陳娜子,姜潮,李校堃.內質網應激與疾病[J].中國生物工程雜志,2016,36(1):76-85.

[3] 張婧,范瑛,汪年松.內質網應激與腎臟疾病[J].中國中西醫結合腎病雜志,2016,17(1):71-75.

[4] 楊瓊,吳永全.內質網應激與心血管疾病[J].心臟雜志,2015,27(1):99-101.

[5] 王崇英,高清祥.細胞生物學實驗[M]. 3版.北京:高等教育出版社,2011.

[6] 閆國棟,權宇彤,湯海峰,等.生命科學實踐教學體系的改革與實踐[J].實驗技術與管理,2015,32(8):6-8,33.

[7] 林躍強,劉曉東,李建.科研成果轉化為實驗教學內容之探索[J].實驗室研究與探索,2015,34(5):144-146,181.

[8] 張英,黎宏宇,李莉,等.流式細胞術在實驗教學中的開發與應用[J],實驗室研究與探索,2013,32(7):206-208,216.

[9] 王宏剛,白艷玲,朱玉山,等.細胞轉染技術在本科實驗教學中的應用[J].實驗技術與管理,2015,32(8):68-69,74.

[10] 丁明孝,蘇都莫日根,王喜忠,等.細胞生物學實驗指南[M].北京:高等教育出版社,2009.

[11] 曾憲錄,巴雪青,朱筱娟.細胞生物學實驗指導[M].北京:高等教育出版社,2011.

[12] 于志軍,柏峰,周春江.深化遺傳學實驗改革,提升學生科研興趣與創新意識[J].高校實驗室工作研究,2015(1):7-8.

[13] 閏曉梅,王蓮蕓,秦敏,等.試論實驗教學中學生科研素質的培養[J].高校生物學教學研究,2013,3(3):39-44.

Application of indirect immune fluorescent technology in experimental teaching of Endoplasmic Reticulum Observation

Wang Honggang, ChenChengbin, Wang Chunguo, Chen Li, Song Wenqin,Bai Yanling, Zhang Jinhong, Liu Fang

(Biological Experimental Teaching Center, Nankai University, Tianjin300071, China)

The experiment ofEndoplasmic Reticulum Observation is always the classical teaching content of Cell Biology experiment, which is carried out byusing vital staining. In order to improve the effect of the experimental teaching, the indirect immunefluorescent technology is applied to the teaching for Endoplasmic Reticulum Observation. In the experiment, by using the antibody monoclonal anti-calreticulin from mouse and FITC-labeledgoat anti-mouse fluorescent secondary antibody, the calreticulin which widely exists in the endoplasmic reticulum is labeled, and the basic shape and distribution of the endoplasmic reticulumin Hela cell are well observed by the fluorescent microscope. Applying the indirect immunefluorescent technology to the teaching of Endoplasmic Reticulum Observation can help our students to learn the technique of endoplasmic reticulum marking which is often used in research, stir up their interest in research work and train their innovative thinking and comprehensive quality of scientific research.

indirect immunefluorescence; endoplasmic reticulum; experimental teaching

10.16791/j.cnki.sjg.2016.10.042

2016-04-01

國家基礎學科人才培養基金“條件建設項目”(J1310003)；南開大學2014年本科一般教學改革項目“將現代實驗技術引入本科實驗教學,構建‘公能’特色實驗教學內容體系”

王宏剛(1982—),男,山西繁峙,碩士,實驗師,從事“細胞生物學實驗”“遺傳學實驗”教學

陳成彬(1972—)男,河北冀州,博士,副教授,研究方向為分子細胞遺傳學,主要從事“細胞生物學”“遺傳學”“細胞生物學實驗”教學.E-mail：chencb@nankai.edu.cn

G642.423

A

1002-4956(2016)10-0168-03