α-突觸核蛋白與血紅蛋白復合物的形成可致線粒體中血紅蛋白減低

楊巍巍　李旭冉　李　昕　李旭穎 　于　順,3*

(1.首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室，北京 100053；2.帕金森病研究北京重點實驗室，北京 100053；3.北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所，北京 100053)

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· 基礎研究 ·

α-突觸核蛋白與血紅蛋白復合物的形成可致線粒體中血紅蛋白減低

楊巍巍1,2李旭冉1,2李昕1,2李旭穎1,2于順1,2,3*

(1.首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室，北京 100053；2.帕金森病研究北京重點實驗室，北京 100053；3.北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所，北京 100053)

目的比較不同年齡段食蟹猴中α-突觸核蛋白(α-synuclein, α-syn)與腦血紅蛋白(neuronal hemoglobin, nHb)復合物在不同亞細胞中的形成。方法免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)及酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測α-syn與nHb復合物在不同年齡段食蟹猴不同腦區亞細胞結構中的表達，免疫印跡(Western blotting)法檢測食蟹猴不同亞細胞結構中游離α-syn與nHb的表達。結果在紋狀體中，nHb-α-syn復合物在胞質組分中存在增齡性增加，而在線粒體組分中存在增齡性減低，并且在紋狀體中，線粒體中游離nHb隨年齡增加而表達減少(P<0.05)；在青、中、老年食蟹猴小腦中，nHb-α-syn復合物在胞質及線粒體組分中并無明顯變化。同時，線粒體中游離nHb不隨年齡增加發生改變。結論在老化腦的易感區，α-syn與nHb復合物的形成可致線粒體游離nHb降低。

α-突觸核蛋白；血紅蛋白；老化；線粒體

腦老化的特征性標志物是纖維蛋白包涵體如路易體(Lewy body，LBs)及路易神經突(Lewy neurites，LNs)的形成[1-2]。α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)是LBs的主要成分，是公認的與老化及帕金森病(Parkinson’s disease PD)發生發展密切相關的蛋白[3-4]。盡管近年來對α-syn的研究取得很多新進展，但其參與老化及PD的病理生理機制尚不明確。近來文獻[5-7]報道α-syn可以與其他蛋白如受體、轉運體及酶等發生相互作用從而參與了α-syn的病理機制。同時，很多蛋白與α-syn共定位于LBs中[8]。

腦血紅蛋白(neuronal Hb，nHb)屬于神經球蛋白家族的一員，主要生理作用為維持線粒體正常功能[9-15]。同時，文獻[16]報道nHb在PD患者腦中表達異常。例如，nHb在PD患者黑質多巴胺能神經元中表達降低并伴隨α-syn沉積[17]。但是，α-syn與nHb是否存在相互作用尚不明確。老化是PD發病的危險因素之一[18]。在老化腦中，同樣觀察到α-syn的聚集并伴隨nHb在線粒體的降低[19]。本文主要觀察不同年齡段食蟹猴不同腦區亞細胞結構中α-syn與nHb的相互作用，可能為闡明PD選擇性損傷的病理機制提供一定的理論依據。

1　材料和方法

1.1材料

健康食蟹猴(4～16歲)12只，購自廣西雄森靈長動物養殖中心，實驗動物許可證號：SYXK(桂)2009～0006， 所有動物均有詳細出生檔案和檢疫證書，動物研究方案經動物福利委員會(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)認證批準。青年猴4只(4歲)，中年猴4只(10～11歲)，老年猴4只(15～16歲)。鼠抗人Hb單克隆抗體(Abcam公司，美國)；鼠抗人α-syn單克隆抗體3D5由本室制備；生物素化的鼠單克隆抗體3D5(康為世紀標記)；4-硝基磷酸二鈉鹽(Sigma公司，美國)；HRP標記山羊抗小鼠IgG多克隆抗體(中杉金橋生物技術有限公司)；ELISA 96孔酶標板(Corning公司，美國)；酶標儀(Tecan公司，瑞士)；其他試劑為分析純。

1.2方法

1)不同年齡段食蟹猴腦組織蛋白樣品制備：抽提青、中、老年食蟹猴紋狀體與小腦的胞質、線粒體及包膜組分，BCA法蛋白定量，-20 ℃保存備用。

2)與血紅蛋白結合的α-syn的酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測：用2 mg/L 血紅蛋白單抗包被96孔酶標板，2.5%(質量濃度)明膠封閉2 h。加入猴腦組織樣品，37 ℃孵育2 h，再加入生物素標記3D5抗體 (終質量濃度1 mg/L)，37 ℃孵育2 h。向各孔加入100 mL堿性磷酸酶標記的親和素 (1∶5 000)，37 ℃孵育1 h。以上每一步驟之后用PBST洗滌各孔4次。最后加入100 mL對硝基酚磷酸顯色液 (pNPP)，37 ℃顯色30 min。405 nm處測定吸光度值。

3)與血紅蛋白結合的α-syn免疫共沉淀檢測：將猴腦組織勻漿20 mg/L與7 mg/L的抗人紅蛋白抗體于4 ℃孵育過夜，然后與protein A 反應，12 000 g離心5 min，棄上清，再加入0.01 mol/L PBS緩沖液500 mL，12 000 g離心5 min后，棄上清，將沉淀用抗α-syn抗體進行α-syn檢測，以分析不同組食蟹猴不同腦區與血紅蛋白結合的α-syn的質量分數。

4)免疫印跡分析：分別取20 μg各組蛋白樣品用10%質量分數 SDS-PAGE分離后，半干法轉移至PVDF膜。將PVDF膜與3D5單抗 (1∶5 000)，Hb(1∶1 000)，Actin (1∶1 000)，VDAC(1∶1 000)，calnexin(1∶1 000)室溫孵育3 h，然后與辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠(或兔)IgG多克隆抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL法檢測辣根過氧化酶活性。

1.3統計學方法

2　結果

2.1檢測與Hb結合的α-syn的ELISA標準曲線的建立

免疫共沉淀及Western blotting結果顯示，α-syn與Hb存在相互作用(圖1A)。本課題組建立的檢測Hb-α-syn復合物的ELISA方法，可以較特異地識別樣本中與血紅蛋白結合的α-syn，而在含有單體α-syn溶液中，僅能檢測到極低的信號(圖1B)。并且此種ELISA方法也可以用于檢測腦組織樣品，而陰性對照及空白對照均無信號出現(圖1C)。

2.2不同年齡段食蟹猴不同腦區nHb與α-syn變化

Western blotting結果顯示，在紋狀體中，α-syn在細胞質表達，線粒體及包膜部位都存在增齡性增加(P<0.05)，而nHb在胞質的表達在青年、中年、老年3組食蟹猴中并無顯著變化；但是在線粒體的表達則隨年齡增加而減少(P<0.05，圖2A～2C)。在小腦中，α-syn表達在線粒體及包膜部位都存在增齡性增加(P<0.05)，但其胞質表達水平在青年、中年、老年3組食蟹猴中差異無統計學意義。而胞質與線粒體組分中nHb表達也不隨年齡發生改變(圖2 D～2F)。

圖1　與Hb結合的α-syn的ELISA標準曲線的建立

圖2　食蟹猴不同腦區nHb與α-syn表達的變化

2.3不同年齡段食蟹猴不同腦區nHb-α-syn復合物形成改變

Western blotting法與ELISA結果顯示在紋狀體部位，與nHb結合的α-syn在胞質組分呈年齡依賴性增加(P<0.05，圖3A)，而在線粒體組分則隨年齡增加而降低(P<0.05，圖3A)。在小腦部位，nHb-α-syn復合物在胞質及線粒體組分中均不隨年齡增加而發生變化(圖3B)。

圖3　食蟹猴不同腦區胞質、線粒體及胞膜組分中nHb-α-syn復合物的檢測

3　討論

利用本室制備的α-syn單克隆抗體(3D5)作為檢測抗體，利用Hb單克隆抗體作為捕獲抗體，筆者建立了可以檢測與Hb結合的α-syn的ELISA方法。并發現其只能檢測與Hb結合的α-syn，提示此法有較高的特異性。

本研究發現了nHb-α-syn復合物存在于食蟹猴不同腦區，并且存在年齡依賴性變化，這個現象有可能闡明了老化腦敏感部位線粒體中nHb降低的原因。在食蟹猴紋狀體中，本課題組發現線粒體中Hb-α-syn復合物隨年齡增加而降低，而胞質中復合物則呈增齡性增加的趨勢。并且本課題組同時發現線粒體中nHb在老年組食蟹猴中降低顯著，而α-syn胞質和線粒體組分則顯著增加。但是，在小腦中，nHb與Hb-α-syn復合物水平在胞質及線粒體組分中則無明顯增齡性變化。由此，推測胞質中α-syn的聚集有可能是線粒體nHb減少的主要原因。

nHb在線粒體和胞質中呈動態平衡分布。而在胞質中積聚的α-syn可致胞質nHb-α-syn復合物增多并減少nHb從胞質轉移到線粒體，從而使線粒體中游離nHb與nHb-α-syn復合物減低。盡管線粒體中積聚的α-syn可致線粒體nHb-α-syn復合物增多進而減少nHb，但是這并不是nHb在線粒體中增齡性減低的主要原因。因為在小腦中，線粒體中α-syn的增加并不伴隨游離nHb的降低。

文獻[10]報道nHb可定位于線粒體并緩解魚藤酮所致線粒體的損傷。而本課題組研究發現，在食蟹猴敏感腦區nHb通過與α-syn形成復合物，從而導致線粒體中nHb增齡性降低，本研究為PD選擇性損傷的機制提供了一定的理論基礎。

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編輯孫超淵

， E-mail：yushun103@163.com

Neuronal hemoglobin in mitochondria is reduced by forming a complex with α-synuclein

Yang Weiwei1,2, Li Xuran1,2, Li Xin1,2, Li Xuying1,2, Yu Shun1,2,3*

(1.DepartmentofNeurobiology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China；2.KeyLaboratoryofNeurodegenerativeDisease,MinistryofEducation,Beijing100053,China；3.CenterforParkinson’sDisease,BeijingInsitituteforBrainDisorders,Beijing100053,China)

ObjectiveIn this study, we observed whether α-synuclein (α-syn) and neuronal hemoglobin (nHb) formed a complex in different subcellular pool of brain regions in aging cynomolgus monkeys. MethodsThe levels of nHb-α-syn complex were detected in different subcellular pools of different regions in aging monkey brains using co-immunoprecipitation (Co-IP) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expressions of free α-syn and nHb were detected in different subcellular pools of aging monkey brains by Western blotting. ResultsIn the striatum, cytoplasmic nHb-α-syn complex increased with age, while mitochondrial nHb-α-syn complex decreased with age and was accompanied by a reduction in mitochondrial free nHb (P<0.05). In contrast, no changes in nHb-α-syn complex formation or free nHb levels were detected in the cerebellum in young, middle age and aged monkey brains. ConclusionThe above results suggest that α-syn forms a complex with nHb in selected regions of the aging brain.

α-synuclein (α-syn)；hemoglobin；aging；mitochondria

國家重點基礎研究發展計劃(2011CB504101)，國家自然科學基金(81071014, 81371200，81401042)，國家科技支撐計劃課題(2012BAI10B03)，首都衛生發展科研專項課題(2011-4001-01)，北京市自然科學基金(7122035)。 This study was supported by National Basic Research Program (“973” Program) of China (2011CB504101), National Natural Science Foundation of China (81071014, 81371200, 81401042), National Science and Technology Support Program (2012BAI10B03), Capital Health Research and Development Special Fund (2011-4001-01), Natural Science Foundation of Beijing (7122035).

時間：2016-10-1610∶58

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1058.034.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.013]

R 338

2016-01-29)