酶聯免疫吸附法檢測水產品中 的氟苯尼考

◎陳成良，黃 湖，梁淑婷，周麗容

（1.深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心，廣東 深圳 518052；2.東莞市國康檢測技術有限公司，廣東 東莞 523071；3.廣州恩康生物科技有限公司，廣東 廣州 510663）

酶聯免疫吸附法檢測水產品中 的氟苯尼考

◎陳成良1，黃 湖2，梁淑婷2，周麗容3

（1.深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心，廣東 深圳 518052；2.東莞市國康檢測技術有限公司，廣東 東莞 523071；3.廣州恩康生物科技有限公司，廣東 廣州 510663）

氯霉素被禁用于動物性食品后，作為氯霉素類藥物的氟苯尼考，在畜牧業中得到廣泛應用，對畜禽疾病的控制和治療起到了重要的作用。隨著研究的深入，發現氟苯尼考也有許多毒副作用。因此，必須控制氟苯尼考在動物性食品中的殘留，以保障消費者的健康。酶聯免疫檢測法（ELISA）是一種簡便、快速、并適合大規模樣品篩選的檢測方法。本實驗運用ELISA方法檢測肉類中殘留的氟苯尼考含量，并得到該方法檢測的靈敏度、檢測下限、交叉反應率、結果重現率等數據，之后用LC-MS對ELISA實驗數據進行方法確認。發現運用ELISA檢測魚、蝦、肉類中氟苯尼考殘留的檢測限可低至0.1 μ g/L，回收率可達70%～120%，重復性好，且實驗數據與LC-MS的數據相關性達到99.98%，這表明ELISA是一種檢測魚、蝦、肉類食品中氟苯尼考殘留的可靠方便的方法。

氟苯尼考；酶聯免疫吸附法；檢測

酶聯免疫吸附（ ELISA）是一種檢測大分子抗原和特異性抗體的方法。該方法將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體在固相表面發生反應［1，2］，由于酶的高效催化可放大反應，使得該檢測方法能達到極高的靈敏度，該方法也被廣泛應用于氯霉素、萊克多巴胺等抗生素或食品添加劑殘留的檢測［3］。ELISA常用類型主要包括間接法測抗體、雙抗體夾心法測抗原［4］以及競爭法測抗原［5］。

氟苯尼考又稱氟代甲砜霉素，是與氯霉素活性相似的廣譜抗生素，對絕大多數革蘭氏陰性和陽性水產病原菌呈高度抗菌活性，具有高效、吸收快等特點，自面市以來得到廣泛應用［6］。尤其是在氯霉素、硝基呋喃類抗生素被禁用后，氟苯尼考在水產品養殖中得到更加廣泛的使用。相對于氯霉素和甲砜霉素而言，氟苯尼考的毒性低、環境污染小、不易引起動物再生障礙性貧血，也不會致畸、致癌和致突變，但具有一定的免疫毒性和胚胎毒性［7］。此外，氟苯尼考的使用也會使得水體中抗生素累積，破壞生態環境，對水產品質量安全造成影響［8，9］。MaxSignalTM氟苯尼考酶聯免疫反應試劑盒基于競爭性酶聯免疫原理研制而成，可用于檢測飼料、魚、蝦、雞蛋、蜂蜜、肉類（牛肉、雞肉、豬肉）、牛奶、奶粉、血清和尿液中氟苯尼考的殘留。

MaxSignalTM氟苯尼考酶聯免疫反應試劑盒為養殖者和政府監督管理部門提供了快速的檢測技術。試劑盒操作簡便、快速。其優點包括：高回收率（＞80%）；前處理方法效果好；高靈敏度（0.15 ） ，低檢出限（魚、蝦、肉類為0.1 μg/L）；快速檢測，在不考慮樣品數量的情況下只需不到2小時；高重現性。

1 實驗原理

MaxSignaLTM氟苯尼考酶聯免疫反應試劑盒基于競爭性酶聯反應原理，相關的氟苯尼考抗體包被于微孔板上，樣品和一抗結合物一并加入到微孔中。如果樣品中存在氟苯尼考，則其將與一抗結合物競爭地與預包被的氟苯尼考抗原結合。此時加入二抗結合物，二抗結合物將與結合了一抗結合物的抗原進行結合，加入底物后，微孔顯色，得到相應的OD值的大小與樣品中氟苯尼考的含量成反比［10，11］。

本實驗還使用液相質譜連用的方式對ELISA檢測結果進行驗證［12，13］。

2 實驗結果

2.1 確定限（CCα，μg/L）

使用美國柏爾MaxSignalTM氟苯尼考ELISA 試劑盒檢測不同樣品中氟苯尼考的確定限如表 1 所示，對肌肉/魚類/蝦中氟苯尼考檢測的確定限可低至0.1 μg/L。

表1 不同樣品中氟苯尼考的確定限表

*CCα：確定限，指等于和高于此值時，用α誤差概率得出認為樣品不符合規定結論的限度，CCα通過對加標樣品進行檢測得出。通過此方法，有50%的實驗結果能根據CCα被檢出。

2.2 檢測容量（CCβ，μg/L）

使用美國柏爾MaxSignalTM氟苯尼考ELISA 試劑盒檢測不同樣品中氟苯尼考的檢測容量如表 2 所示。

表2 不同樣品中氟苯尼考的檢測容量表

2.3 回收率

使用美國柏爾MaxSignalTM氟苯尼考ELISA 試劑盒檢測不同樣品中氟苯尼考的回收率如表 3 所示。

表3 不同樣品中氟苯尼考的回收率表

平均回收率通過對每個不同種類的樣品分別進行20次平行加標（以CCβ為加標量）實驗得出。變異系數（CV）小于20%。（這里是表的注釋）

2.4 特異性（交叉反應率）

使用美國柏爾MaxSignalTM氟苯尼考ELISA 試劑盒檢測各種與氟苯尼考同類的抗生素藥物的靈敏度及交叉反應率如表 4 所示。

表4 各種同類抗生素藥物的靈敏度及交叉反應率表

2.5 精密度和重現性

由表5可知標準品組內實驗變異系數＜7%。

表5 標準品組內實驗的變異系數表

變異系數CV=（S.D./μ）×100，S.D.為10次重復實驗的標準偏差，μ為10次重復實驗的平均值

2.6 標準曲線

如圖1所示，標準品濃度與相對吸光值成反比關系。

圖1 氟苯尼考標準曲線圖

2.7 試劑盒抗體的重現性

不同濃度的標準品，用本ELISA試劑盒在進行10次的平行檢測實驗后，組內的變異系數均小于5%，說明試劑盒標準品的重現性好，見表6。

表6 試劑盒標準品的精密度表

2.8 方法確認

對魚類/蝦/肉類（牛/雞/豬）分別進行氟苯尼考一定濃度的加標實驗，加標后操作流程如下：

（1）用適當的均質器進行均質；

（2）取3 g均質后樣品，加入6 mL乙酸乙酯，最大速度漩渦振蕩3 min；

（3）室溫下4000 r/min離心5 min；

（4）移取4 mL上清液（含2 g待測樣品）到另一試管中，60～70℃旋轉蒸發或氮氣吹干；

（5）加入2 mL正己烷溶解；

（6）加入1 mL 1×樣品提取液，最大速度漩渦振蕩2 min；

（7）室溫下4000 r/min離心10 min，去掉上層正己烷層；

（8）移取50 μL下清液即可用于檢測。若出現乳化現象，去掉上層正己烷層后，將下層清液 80～95 ℃水浴3 min后即可用于ELISA檢測（樣品同樣可用于進行LC-MS確認）。

注：稀釋倍數為0.5。

使用ELISA試劑盒和LC-MS同時對樣品進行檢測，結果見表7。

表7 ELISA試劑盒與LC-MS檢測結果對照表

（1）假陰性：當LC-MS檢測結果＞1 ppb，ELISA檢測結果＜1 ppb，即為假陰性；

（2）假陽性：當LC-MS檢測結果＜1 ppb，ELISA檢測結果＞1 ppb，即為假陽性；

3 結論

對肉類進行加標實驗的結果表明：美國柏爾MaxSignalTM氟苯尼考ELISA檢測方法能靈敏地檢測到樣品低至0.1 ppb的氟苯尼考。另外該檢測方法還擁有以下優點；高回收率（70%～120%）；高重復性；96孔高通量定量檢測；使用快速的提取方法縮短樣品前處理的時間和成本。更為重要的是，美國柏爾MaxSignalTM氟苯尼考ELISA檢測方法與LC-MS檢測方法的相關性非常好，相關系數達到99.98%。以上結果表明，美國柏爾公司的MaxSignalTM氟苯尼考ELISA檢測試劑盒給政府部門、水產加工行業、質量監督管理部門提供了一種簡單、快速、準確、高效、低成本的檢測方法。

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The Inspection of Florfenicol in Aquatic Products by ELISA

Chen Chengliang1， Huang Hu2， Liang Shuting2， Zhou Lirong3
（1.Shenzhen Agricultural Product Quality Safety Inspection Testing Center， Shenzhen 518052， China；2.Dongguan Guokang Detection Technology Co.， Ltd， Dongguan 523071， China；3.Guangzhou Ancon Biotechnology Co.， Ltd， Guangzhou 510663， China）

As a kind of chloramphenicol drug， f lorfenicol has been widely applied in animal husbandry after chloramphenicol was forbidden using in animal foods， which is playing significant role in control and therapy of diseases in livestock and poultry. With deep research， the using of florfenicol was also found causing a lot of toxic side effects. Therefore， the quantity of residual florfenicol in animal foods should be taken in control so as to guarantee consumers' health. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） is a simple， quick inspection method which is terribly suitable for large scale sample screening. The paper inspected the residual florfenicol in meat by means of ELISA， as well as obtained the data on sensitivity， detect limit， spec ificity and replication percentage of the means. Then， LC-MS was used to validate the dependability of ELISA. The detection limit of f lorfenicol in meat can be as low as 0.1 μg/L by the means of ELISA， the recovery rates was up to 70%～120%， and the relevance between LC-MS and ELISA up to 99.98%， all the data shows that ELISA is a dependable and convenient methods to inspect the residual florfenicol in meat.

Florfenicol； Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）； Inspection

S859.84

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.14.036

陳成良（1979-），男，廣東深圳人，本科，中級工程師，主要研究方方向為農產品質量安全檢測。