斑貞1號、TMP和5-FU聯(lián)合對人胃癌細(xì)胞ERCC1表達(dá)的影響

張愛民 郝海燕 郝旺勝 馬振華.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古包頭0400；.內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市第四醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古包頭04030

斑貞1號、TMP和5-FU聯(lián)合對人胃癌細(xì)胞ERCC1表達(dá)的影響

張愛民1郝海燕2郝旺勝1馬振華1
1.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古包頭014010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市第四醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古包頭014030

目的探討斑貞1號、川芎嗪（TMP）和五氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)合逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞系SGC-7901/ADR與ERCC1表達(dá)的影響。方法采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），監(jiān)測人胃癌細(xì)胞SGC-7901/ADR細(xì)胞在5-FU組、斑貞1號組、斑貞1號+5-FU組、斑貞1號+5-FU+TMP組切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果5-FU組與陰性對照組比較，ERCC1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而5-FU聯(lián)合中藥斑貞1號及TMP處理組ERCC1mRNA表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論斑貞1號、TMP和5-FU聯(lián)合逆轉(zhuǎn)SGC-7901/ADR細(xì)胞耐藥性可能與ERCC1基因相關(guān)，為當(dāng)前胃癌的治療提供了新的理論依據(jù)。

胃癌；斑貞1號；TMP；5-FU；多藥耐藥；ERCC1基因

胃癌是中國常見的惡性腫瘤之一，至今為止手術(shù)仍是胃癌的主要治療方法，因早癌診斷率低，70%患者失去手術(shù)機(jī)會，所以化療顯得非常重要，但目前最大的問題是胃癌多藥耐藥性（MDR），近幾年發(fā)現(xiàn)［1，2］ER CC1參與胃癌的多藥耐藥，并起重要作用，本課題組侯培珍等［3］研究結(jié)果示斑貞1號、5-FU和TMP聯(lián)合對人胃癌有逆轉(zhuǎn)作用。本課題采用RT-PCR方法比較人胃癌細(xì)胞（SGC-7901/ADR）經(jīng)過不同藥物組治療后的ERCC1 mRNA的表達(dá)量，進(jìn)一步探討各藥物組對人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞的作用機(jī)制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞，第四軍醫(yī)大贈。

1.2 藥物、試劑及主要儀器

自擬“斑貞1號”每毫升含露蜂房、山茱萸、斑蝥、女貞子各0.2 g。5-FU（規(guī)格：10 mL∶0.25 g，國藥準(zhǔn)字H31020593，上海旭東海普藥業(yè)有限公司）、TMP（規(guī)格40 mg，國藥準(zhǔn)字H20031302，安徽制藥），RPMI1640培養(yǎng)基（RPMI為Roswell Park Memorial Institute縮寫，1640是培養(yǎng)基代號，其中含有10%胎牛血清，美國GIBCO北京有限公司），二甲基亞砜、胰蛋白酶（美國Sigma公司產(chǎn)品），新生小牛血清（杭州四季青公司），兩步法RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品），引物片段（上海生物工程公司），PCR擴(kuò)增儀（Ambion公司）、電泳儀及紫外分光度計（北京六一公司），Trizol（TakaRa公司），紫外透視成像系統(tǒng)（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞處理取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×104/mL濃度接種于6孔板上，每孔用吸管加入2 mL，然后培養(yǎng)24 h，然后分為五組；對照組、5-FU組、斑貞1號組、斑貞1號+5-FU、斑貞1號+5-FU+TMP，分別加入等量的新的培養(yǎng)液，5-FU稀釋液、斑貞1號稀釋液、斑貞1號+5-FU稀釋液、斑貞1號+5-FU+TMP稀釋液。培養(yǎng)48 h后，經(jīng)過PBS緩沖液沖洗，提取總mRNA。

1.3.2 RT-PCR提取細(xì)胞中的總RNA：以mRNA為模板，采用Oligo隨機(jī)引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后再以cDNA作為模板PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳并拍照，分析電泳條帶灰度值，檢查基因mRNA轉(zhuǎn)錄相對量的變化。具體步驟如下：以mRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，每個反應(yīng)體系25 μL，目的基因引物各0.5 μL，Takara Taq 1 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，ddH2O 13.5 μL；各樣品cDNA 5 μL，滅菌蒸餾水13.5 μL。經(jīng)過預(yù)變性→變性→退火→延伸，（PCR擴(kuò)增條件分別為94℃1 min，58℃30 s，72℃45 s，72℃10 min），共30個循環(huán)，最后延伸72℃10 min，擴(kuò)增結(jié)束，取10 μL樣品，跑電泳60 min，（經(jīng)100 V恒壓，2%瓊脂糖）然后采集電泳圖像，得出各電泳帶光密度值，β-action引物正義列為5’-GTGGG GCGCAGGCACCA-3’，反義列為5’-CTCCTTAATACGCACGATTTC-3’ERCC1基因引物序列的正義列引5-TCAGACCTTCGCCGTATATGC-3’，反義列引物為5’-ACATCCACATGGACCAG-CAGG-3’。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞ERCC1 mRNA的表達(dá)情況

5-FU組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。其他藥物組與對照組相比及組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同藥物組處理后SGC7901/ADR細(xì)胞的ERCC1 mRNA表達(dá)±s）

表1 不同藥物組處理后SGC7901/ADR細(xì)胞的ERCC1 mRNA表達(dá)±s）

注：A組與B組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.44，P＞0.05），C組、D組、E組與A組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.95、11.36、14.40，P＜0.05）；C組與B組比較t=6.50；D組與C組比較t=4.91，E組與D比較t=2.58，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）

組別ERCC1相對光密度值A(chǔ)（對照組）B（5-FU組）C（斑貞1號組）D（斑貞1號+5-FU組）E（斑貞1號+5-FU+TMP組）F值P 1.89±0.28 1.84±0.25 2.89±0.24 3.51±0.23 4.14±0.04 84.616＜0.05

2.2 ERCC1和對照基因β-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后電泳圖

切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）和對照基因（β-action）的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后分別位于354bp和548bp，見圖1。

圖1 ERCC1和對照基因β-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后電泳圖

3 討論

目前我國胃癌發(fā)病率及死亡率位居惡性腫瘤第三位［4］，化療是胃癌治療中其重要作用，但大部分藥物因多藥耐藥（MDR）使化療失敗［5］。

近年研究發(fā)現(xiàn)ERCC1基因與惡性腫瘤的多藥耐藥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、療效預(yù)測及預(yù)后相關(guān)。此基因在許多腫瘤組織中表達(dá)低下，對頭頸部鱗癌的研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1水平低表達(dá)可能是發(fā)生頭頸部癌的危險因素，在對食管癌和胃食管結(jié)合部癌的研究中，發(fā)現(xiàn)ERCC1的表達(dá)降低與惡性腫瘤的發(fā)病率增加有關(guān)，在胃癌的研究中也得到了相似的結(jié)果。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)［6］ERCC1的表達(dá)水平與化療敏感性密切相關(guān)，認(rèn)為其表達(dá)水平對進(jìn)展期胃癌患者的臨床療效進(jìn)行有效預(yù)測。馬冬等［7］回顧性分析發(fā)現(xiàn)ERCC1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)而與腫瘤大小、浸潤深度無關(guān)。而胡鏘、于東風(fēng)等［8］研究卻發(fā)現(xiàn)此基因表達(dá)水平與患者性別、年齡、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性。而李紫燕等［9］研究發(fā)現(xiàn)此基因在胃癌組織中表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類型、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)均無關(guān)，而與性別有相關(guān)，趙國華、吳杰等［10］發(fā)現(xiàn)ERCC1陰性的胃癌患者采用5-Fu和奧沙利鉑化療的療效更好。李紅等［11］研究發(fā)現(xiàn)ERCC1在胃癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級及研究中，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯差異，本課題組先前已證實(shí)胃癌細(xì)胞對5-FU耐藥性，ERCC1（切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因）是Westerveld等在1984年發(fā)現(xiàn)的，此基因定位于人類第19號染色體短臂13.2～13.3位點(diǎn)上，大小為15 kb，ERCC1基因擁有四種分子量的mRNA，但只有1.1kb mRNA具有核苷酸切除修復(fù)作用。關(guān)于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的學(xué)說認(rèn)為腫瘤是致癌相關(guān)的危險因素暴露造成DNA損傷，再加上DNA修復(fù)基因表達(dá)低下造成基因損傷不斷地在上皮細(xì)胞內(nèi)累積導(dǎo)致癌基因和抑癌基因突變等一系列連續(xù)事件作用的結(jié)果。ERCC1基因表達(dá)低下影響細(xì)胞對DNA加合物及核苷酸損傷的修復(fù)，可導(dǎo)致p53、K-RAS基因突變增加，從而增加惡性腫瘤的發(fā)生率［12］。ERCC1修復(fù)了損傷的基因，使基因組保持完好，減少了癌變相關(guān)基因的出現(xiàn)，使細(xì)胞能保持正常的生物學(xué)活性，從而減少癌變的幾率，降低了腫瘤的發(fā)病率［13，14］。

斑貞1號合劑（斑蝥、露蜂房、女貞子、山茱萸），斑蝥能抑制腫瘤細(xì)胞DNA和RNA合成，殺傷腫瘤。它對HeLa細(xì)胞及人食管、胃、肝、乳腺癌細(xì)胞均有抑制作用，能促進(jìn)造血干細(xì)胞分化，加速粒細(xì)胞的釋放，很好地對抗了放化療中血細(xì)胞下降，減少了不良反應(yīng)。TMP通過多種途徑對腫瘤起到治療和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。楊葉等［15］已證實(shí)TMP能增加5-FU對胃癌化療的敏感性。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)斑貞1號、5-FU和TMP三聯(lián)藥物處理組胃癌細(xì)胞ERCC1 mRNA表達(dá)量高于其他用藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明三種藥聯(lián)合可顯著提高ERCC1 mRNA的高表達(dá)，增強(qiáng)了治療效果。

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Effects of combined Banzhen 1，TMP and 5-FU on the expression of human gastric cancer cell ERCC1

ZHANG Aimin1HAO Haiyan2HAO Wangsheng1MA Zhenhua1
1.Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou014010，China；2.Department of Gastroenterology，the Fourth Hospital of Baotou City in Inner Mongolia Autonomous Region，Baotou 014030，China

Objective To explore the effects of combined Banzhen 1，TMP and 5-FU on reversing human gastric cancer cell line SGC-7901/ADR and the expression of ERCC1.Methods Semi-quantitative RT-PCR was applied to monitor the expression of ERCC1 mRNA in human gastric cancer cell SGC-7901/ADR cell in 5-FU group；Banzhen 1 group；Banzhen 1 group+5-FU group；Banzhen 1+5-FU+TMP group.Results 5-FU group and negative control group were compared，and the difference of ERCC1 mRNA expression was not significant（P＞0.05），but ERCC1 mRNA ex pression volume in 5-FU combined with TCM Banzhen 1 group and TMP group was significantly improved（P＜0.05）.Conclusion Combined Banzhen 1，TMP and 5-FU in reversing drug resistance of SGC-7901/ADR cell may be correlated with ERCC1 gene，which provides new theoretical evidence for the treatment of gastric cancer.

Gastric cancer；Banzhen 1；TMP；5-FU；Multiple resistance；ERCC1 gene

R735.2

A

1673-9701（2016）26-0034-03

2016-06-04）