雷公藤多苷對狼瘡鼠肝腎組織中11β-羥基類固醇脫氫酶的影響

張　博　方險峰　安永濤

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·論著·

雷公藤多苷對狼瘡鼠肝腎組織中11β-羥基類固醇脫氫酶的影響

張博1方險峰2安永濤1

目的：明確雷公藤多苷對MRL/lpr狼瘡小鼠肝臟組織中11β-羥基類固醇脫氫酶1(11β-HSD1)和腎組織中11β-羥基類固醇脫氫酶2(11β-HSD2)表達的影響。方法：將14只MRL/lpr狼瘡鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組8只給予雷公藤多苷15 mg/kg灌胃，每天1次，連續15天，其余6只作為空白對照。免疫組化、RT-PCR分別檢測11β-HSD的IOD值和mRNA的表達。結果：實驗組中11β-HSD1的IOD和mRNA分別為1.03±0.05和1.55±0.09，高于對照組的0.83±0.04和1.23±0.07，(P<0.05)；實驗組中11β-HSD2的IOD和mRNA為0.86±0.06和1.10±0.04低于對照組中的0.90±0.05和1.15±0.06)，差異無統計學意義(P>0.05)。結論：雷公藤多苷可誘導肝臟中11β-HSD1的表達。

雷公藤多苷；系統性紅斑狼瘡；11β-羥基類固醇脫氫酶

雷公藤多苷是中藥雷公藤的提取物，由于其能夠興奮下丘腦-垂體-腎上腺軸，使下丘腦、垂體及腎上腺皮質結構發生改變，如皮質的增厚、束狀帶細胞的肥大、增生，從而引起功能增強，產生類激素樣作用[1]，是臨床上治療SLE的常用藥物，療效肯定。以往的研究主要認為與其刺激皮質醇分泌、提升糖皮質激素受體水平有關，而對體內糖皮質激素代謝的關鍵酶11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-HSD)的表達有無影響則未見相關報道，本文從動物實驗入手，探討雷公藤多苷對11β-HSD在特異性器官中的表達是否有影響。

1　實驗材料

1.1動物MRL/lpr狼瘡雌性小鼠14只，14～22周齡，體重42～50 g,購于上海實驗動物中心，飼養在清潔動物房中。

1.2材料雷公藤多苷藥粉(江蘇美通制藥有限公司，生產批號080525)，羊抗鼠11β-HSD1、11β-HSD2一抗(圣克魯斯生物技術公司)，生物素標記兔抗羊二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，防脫片劑(北京博奧森生物技術有限公司)，TRIzol(碧云天生物技術公司)，逆轉錄試劑盒(MBI Fermentas)，7300美國ABI進口實時熒光定量PCR擴增儀，生物顯微鏡PH100(深圳西派克光學儀器有限公司)。

2　實驗方法

2.1動物實驗將14只MRL/lpr雌性小鼠隨機分為A、B兩組，A組8只按15 mg/kg劑量的雷公藤多苷融于0.5%羧甲基纖維素鈉給鼠進行灌胃，每天1次共15天。B組6只使用等量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，作為空白對照組。15天后處死小鼠，取出其肝臟及腎臟，置于標本保存液中冷凍保存，待用。

2.2免疫組化檢測將收集的小鼠肝腎組織置于4℃丙酮中固定12 h，石蠟包埋。切片、脫臘、抗原熱修復后，采用SP法進行免疫組化染色，依次經過3%氧化氫孵育、0.5% TritonX-100破膜、血清封閉、一抗孵育(此步驟中肝臟組織切片中加入的是羊抗鼠11β-HSD1一抗，腎臟組織切片中則加入羊抗鼠11β-HSD2一抗)、二抗孵育，二氨基聯苯胺(DAB)顯色、水洗，蘇木素復染、脫水、封片。每張細胞涂片隨機選取5個高倍顯微鏡下視野，采用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件讀取數據，分別測定每個視野中積分光密度IOD值，最終以平均IOD值表示。

2.3定量Rt-PCR檢測①取出冰凍的肝腎組織10 g，加入TRIzol提取總RNA，完全按照試劑盒說明書進行操作，將組織總RNA逆轉錄為cDNA。②使用上海生工生物工程有限公司合成的11β-HSD1引物對肝臟中的11β-HSD1進行擴增，上游引物:5'-GCAGAGCGATTTGTTGTT-3'，下游引物:5'-TGTCTATGAAGCCGAGGA-3'。使用大連寶生物工程有限公司合成的11β-HSD2引物對腎臟中11β-HSD2進行擴增，上游引物:5'-GACCTTAGCCCCGTTGTA-3'，下游引物:5'-GGCAGGTAGTGGTGGATG-3'。以β-actin為內參照，上游引物:5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物:5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。③用ABI7300美國進口實時熒光定量PCR擴增儀進行PCR擴增，按照熒光定量PCR擴增試劑盒說明書進行操作。擴增條件:預變性95℃ 30 s；PCR反應95℃ 5 s、60℃ 30 s，共30周期。擴增后進行熔解曲線分析，監測并收集熒光信號，建立PCR產物的熔解曲線，使用2-△△Ct法計算各標本目的基因的相對表達量。

3　結果

3.1雷公藤多苷的治療作用實驗過程中，可以觀察到A組小鼠的食欲不佳、活動度低下以及毛發脫落現象在隨著藥物的使用后有所改善，實驗結束后測其尿蛋白為(2.20±1.13)mg/24 h，明顯低于對照組的(4.01±2.02)mg/24 h。

3.2雷公藤多苷對肝細胞中11β-HSD1表達的影響光鏡下11β-HSD1被染成棕黃色(圖1、2)，主要分布于肝細胞的胞內，分析后發現治療組小鼠肝臟組織中11β-HSD1的表達要高于空白對照組，差異明顯。免疫熒光PCR定量檢測發現， 表達也高于空白對照組，P<0.05，與11β-羥基類固醇脫氫酶的高表達是一致的，提示雷公藤多苷可以誘導狼瘡小鼠肝臟組織中11β-HSD1的表達(表1)。

表1　雷公藤多苷對狼瘡大鼠肝腎組織中11β-HSD表達的影響

注：A、B組相比肝臟中P<0.05，差異具有統計學意義，腎臟中P>0.05，差異無統計學意義

圖1、2　肝臟組織中的11β-HSD1(免疫組化，×40)

3.3雷公藤多苷對腎臟細胞中11β-HSD2表達的影響 被染成棕黃色的11β-HSD2主要分布于腎臟細胞的胞內(圖3、4)，治療組小鼠腎臟組織中11β-HSD2的表達稍低于空白對照，但差異不明顯。定量PCR檢測發現，治療腎臟組織中11β-HSD2 mRNA的表達同樣稍低于空白對照組，P>0.05，差異不明顯，提示雷公藤多苷對狼瘡鼠腎臟中11β-HSD2的表達無影響(表1)

圖3、4腎臟組織中的11β-HSD1(免疫組化×40)

4　討論

11β-HSD為體內糖皮質激素代謝的關鍵酶，有兩種亞型，11β-HSD1可將無活性的可的松轉化為有活性的氫化可的松，其中肝臟組織表達最高，相關研究表明其活性及分泌異常與代謝綜合征、肥胖癥、胰島素抵抗、高血壓等疾病相關[2]；11β-HSD2主要分布于腎臟組織中，具有滅活皮質醇、保持腎臟對鹽皮質激素敏感的特異性作用，與潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、哮喘等疾病有關系[3]。

既往研究證實雷公藤多苷具有類糖皮質激素樣作用，可刺激下丘腦-垂體-腎上腺皮質，可以增加皮質醇的分泌[4]，提升糖皮質激素受體表達等[5]，提示雷公藤可從不同環節提升內源性激素效應。11β-HSD1/2是糖皮質激素代謝關鍵酶，調節皮質醇/皮質酮轉化，雷公藤的擬激素作用是否與此有關，尚未見報道。

本實驗發現，雷公藤灌胃后肝臟11β-HSD1在基因轉錄及蛋白表達水平均有顯著提高，提示其擬激素作用包含對皮質醇/皮質酮轉化調節，提升細胞內皮質醇含量，臨床治療過程中，聯合用藥有助于降低激素用量，減輕其不良反應[6,7]。

SLE患者都有不同程度的腎損害，原因為沉積于腎臟組織中的免疫復合物引起炎癥反應所致，本實驗研究發現雷公藤多苷對腎臟組織中11β-HSD2的表達影響不明顯。因此，雷公藤對內源性糖皮質激素代謝的影響主要是通過增加皮質醇的分泌、增強糖皮質激素受體表達、提升肝臟11β-HSD1基因轉錄及蛋白表達水平方面實現的。

[1] 李樂真,陳芍藥,譚宮屏,等.雷公藤提取物對垂體-腎上腺皮質系統的影響[J].中成藥研究,1983,10:23-24.

[2] 崔同軍,葉磊,辛婧.11β-羥基類固醇脫氫酶通過改變糖皮質激素活性參與機體多個病理環節[J].醫學綜述,2013,19(1):40-42.

[3] 陳曉琳,王麗娜,王興友.11β-羥基類固醇脫氫酶2與炎性疾病的關系[J].醫學綜述,2011,17(12):1769-1772.

[4] 茆文杰,陳龍.雷公藤與下丘腦-垂體-腎上腺軸關系的研究進展[J].中國臨床藥學,2009,18(2):120-122.

[5] 劉毅,葉松柏,金彰紅.雷公藤多苷對糖皮質激素受體的影響研究[J].川北醫學院學報,2000,15(2):4-6.

[6] Stimson RH, Walker BR. Glucocorticoids and 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in obesity and the metabolic syndrome[J]. Minerva Endocrinol,2007,32:141-159.

[7] 王興友,陳杭薇,錢桂生.11β-羥基類固醇脫氫酶的研究[J].醫學綜述,2007,13(24):1050-1051.

(收稿：2015-11-15修回：2016-02-15)

Effect of tripterygium glycosides on the expression of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase in liver and kidney of MRL/lpr mice

ZHANGBo1,FANGXianfeng2,ANYongtao1.

1.GuangxiTraditionalChineseMedicineUniversity,Nanning530000,China; 2.RuiKangAffiliatedHospitalofGuangxiTraditionalChineseMedicineUniversity,Nanning530000,China

Correspondingauthor:FANGXianfeng,E-mail:fxf777@qq.com

Objective: To determine the effects of tripterygium glycosides (TG) on the expression of 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase1 (11β-HSD1) in liver and 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase2 (11β-HSD2) in kidney of MRL/lpr mice. Methods: Fourteen MRL/lpr mice were randomly divided into two groups. Eight mice in the experimental group were given TG, 15 mg/kg, once a day, for 15 days. Six mice were used as blank controls. The expression of 11β-HSD1 and 11β-HSD2 was detected by immunohistochemistry and PCR. Results: The IOD and mRNA of 11β-HSD1 in the experimental group were 1.03±0.05 and 1.55±0.09, which was higher than those in the control group (0.83±0.04 and 1.23±0.07), with a significant difference (P<0.05). The IOD and mRNA of 11β-HSD2 in the experimental group were 0.86±0.06 and 1.10±0.045, which was lower than those in the control group (0.90±0.05 and 1.15±0.06), with no significant difference (P>0.05). Conclusion: Tripterygium glycosides can induce the expression of 11β-HSD1 in liver.

tripterygium glycosides; systemetic lupus erythematosus; 11β-hydroxysteroid dehydrogenase

國家自然科學基金(編號：81260593)

1廣西中醫藥大學，廣西南寧，530000

2廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西南寧，530000

方險峰，E-mail：fxf777@qq.com

廣西壯族自治區自然科學基金

(編號：2012GXNSFAA053101)

廣西壯族自治區教育廳科研項目(編號：201203YB105)