八種氟喹諾酮類藥物人工抗原的合成及鑒定

李琳+萬忠海++文學忠

摘 要：建立諾氟沙星（ Enrofloxacin，NOR）、環丙沙星（Ciprofloxacin，CIF）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、雙氟沙星（Difloxacin ，DIF）、培氟沙星（Pefloxacin，pef）和氟羅沙星（Fleroxacin，FLX，）8種氟喹諾酮類藥物人工抗原的合成及鑒定方法。采用碳二亞胺（EDC）法將8種氟喹諾酮類藥物與載體蛋白進行偶聯，用于制備免疫抗原與包被抗原，通過紫外掃描和SDS-PAGE 對人工抗原進行鑒定，免疫原免疫Balb/c 小鼠，獲得抗體。試驗結果表明，采用間接ELISA方法檢測小鼠血清抗體效價均達到1：8000以上。為進一步制備抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體提供了良好的免疫原。

關鍵詞：氟喹諾酮；人工抗原；合成；鑒定

中圖分類號：R978.1 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160832005

氟喹諾酮藥物（fluoroquinolones，FQs），又名6-氟喹諾酮類，是第3代喹諾酮類抗菌藥。相比第1代和第2代喹諾酮類藥物（quinolones，QNs）具有抗菌譜更廣、抗菌作用更強、副作用低和不易產生耐藥性等特點，故在醫學和獸醫學中很快取得廣泛應用。FQs是小分子化合物，屬于半抗原，將其與蛋白質載體進行偶聯后，再制備成完全抗原，即指小分子物質必須和載體蛋白偶聯之后方能刺激機體產生特異性的抗體，并包被于固相載體上用于ELISA檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑

諾氟沙星（99.6%）、環丙沙星（99.7%）、恩諾沙星（100%）、沙拉沙星（99.6%）、氧氟沙星（99.0%）、雙氟沙星（100%）、培氟沙星（98%）和氟羅沙星（99.1%）購買于中國獸醫藥品監察所；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、碳二亞胺（EDC）、卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均購買于Sigma-Aldrich公司，其余試劑均為國產分析純購于鼎國生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器

BECKMAN DU-640核酸蛋白分析儀（USA）；自動凝膠成像儀（美國伯騰）； SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海壘固）；超純水儀（ELGA）； CO2細胞培養箱（力康HF90型氣套式）； -80℃冰柜（日本三洋）；TECAN酶聯免疫檢測儀（AUSTRIA）。

1.1.3 試驗動物和細胞

雌性，8周齡，體重14～16g BALB/c 小鼠購于長春市生物制品所；SP2/0骨髓瘤細胞，由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 完全抗原的制備采用碳二亞胺法

8種氟喹諾酮藥物完全抗原制備方法步驟基本相同，但秤取的量不盡相同，詳見試劑質量配比表。實驗步驟如下：準確稱取N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）A mg，碳二亞胺（EDC）B mg，氟喹諾酮藥物 C mg，加入 D μL 的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）此溶液命名為Ⅰ，并放置在室溫下遮光攪拌孵育24h；準確稱取牛血清白蛋白（BSA）E mg， 加入0.01 mol/L（pH 值7.4）磷酸鹽緩沖液（PBS）F mL，此溶液命名為Ⅱ。將孵育好的溶液Ⅰ逐滴加入到Ⅱ，同時攪拌，室溫下攪拌3h。 反應結束，用0.01 mol/L（pH 值7.4）PBS 透析，透析后溶液定容至3 mL，零下20℃分裝保存。合成包被抗原方法同上。

1.2.2 試劑質量配比表

1.2.3 偶聯產物分析及分子結合比測定

采用聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分析和紫外分光光度法測定半抗原與載體蛋白的分子結合比方法測定。

1.2.4 完全抗原的鑒定

采用SDS-PAGE 凝膠電泳鑒定和紫外掃描鑒定。

1.2.5 雌性56日齡BALB/c小鼠（體重14～16g），分成3批次進行免疫（4只/批）

混合完全抗原與等量福氏完全佐劑乳化完全后作為首次免疫用，以劑量為200?g/只注射腹腔。第2次免疫在28d后進行，加強免疫時間間隔為14d1次，換用福氏不完全佐劑，其余同前。小鼠斷尾采血在第3次免疫后進行，檢測血清效價采用間接ELISA方法，待血清效價達到1：8000以上。融合前3d，不加佐劑，進行強化免疫。

1.2.6 小鼠血清效價測定及檢測方法

小鼠尾部采血0.1mL，5000r/min離心5min，收集血清，采用間接ELISA方法檢測血清效價，并設陰性和空白對照。

2 結果與分析

2.1 8種氟喹諾酮類藥物

與BSA的偶聯產物BSA-X（8種氟喹諾酮類藥物）聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分析及其與OVA的偶聯產物OVA-X聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分析結果可以看出：偶聯物的電泳條帶與載體蛋白均不相同，證實已經成功偶聯。

2.2 紫外分光光度法測定半抗原與載體蛋白的分子結合比

將每種溶液稀釋至200?g/mL（偶聯產物按蛋白計），經過紫外掃描獲得每種溶液的紫外吸收光譜，并發現BSA、X、BSA- X3者的紫外吸收光譜差異明顯（OVA及其處理對照類同），可以說明偶聯成功。而經測定各溶液的吸光值，代入公式計算X與BSA和OVA的分子結合比分別為2：1和3：1不等。

2.3 免疫小鼠血清抗體效價

8周齡BALB/c雌鼠進行首免，三免10d后應用間接ELISA法檢測小鼠血清效價通過實驗獲得小鼠均已經產生了特異性抗體。

2.4 篩選方法的可行性分析

分別把BSA、OVA、BSA-X（8種氟喹諾酮類藥物）和OVA-X 5μg/ml包被過夜，每孔100μl。陰性血清1：400倍稀釋，陽性血清1：4000倍稀釋，并設置空白對照。顯示結果為OVA與陽性血清反應的OD值在0.1左右，表明與OVA發生特異性反應。而陽性血清與BSA-X反應的OD值比與BSA反應的OD值要高，這樣陽性血清中不僅產生了針對BSA的抗體還產生了針對8種氟喹諾酮類藥物的抗體。因此采用OVA-X作為包被抗原是必須且可行的。

3 小結

3.1 氟喹諾酮類藥物

是獸醫臨床常用的一種獸藥，近年來使用量較大。由于其具有潛在致癌的危害性，故而一旦在畜禽產品中殘留量過高，人類長期使用便會危及健康。同時對畜牧業發展也會產生重要的影響，帶來巨大的經濟損失。

3.2 本試驗

將8種氟喹諾酮類藥物與蛋白質載體偶聯制備人工抗原，該試驗結果奠定了8種氟喹諾酮類藥物ELISA檢測試劑盒組裝的理論和實踐基礎。

參考文獻

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