近期泰安周邊地區鴨病毒性肝炎流行情況調查

程子龍吳海波于濤岳瑞超劉思當*

1.山東農業大學動物科技學院，山東泰安271018

2.山東大寶養殖加工有限責任公司，山東泰安271000

3.新泰市新甫街道獸醫站，山東泰安271200

近期泰安周邊地區鴨病毒性肝炎流行情況調查

程子龍1，吳海波2，于濤3，岳瑞超1，劉思當1*

1.山東農業大學動物科技學院，山東泰安271018

2.山東大寶養殖加工有限責任公司，山東泰安271000

3.新泰市新甫街道獸醫站，山東泰安271200

為探究泰安周邊地區接種鴨病毒性肝炎疫苗或打了卵黃抗體的鴨群仍然發生病毒性肝炎的真正原因，我們對2014年4～8月份送檢的10份疑似鴨病毒性肝炎病例進行了剖檢診斷、組織病理學觀察及RT-PCR檢測，并進行遺傳進化及同源性分析。結果顯示，10份病例在臨床癥狀及病理學變化上均符合鴨病毒性肝炎的特征，但只有7份病例PCR診斷為DHV陽性，3份為陰性。這7份病毒的VPO基因同源性在98.6%～100%，與DHV-A、DHV-B處于不同分支，同源性均不足76%，與中國分離株JS2010、C-YCW處于較小的分支上，同源性在98.3%～98.9%，親緣關系最近，但為不同小分支，表明我們檢測到的鴨病毒性肝炎毒株為DHV-C型，但與中國分離株JS2010、C-YCW存在一定差異性。以上結果表明，DHV-C已成為魯中地區當前流行的優勢毒株，注射針對DHV-A的疫苗或卵黃抗體無效現象的發生可能與此有關。

鴨病毒性肝炎；流行；新型

鴨病毒性肝炎（DVH）是由鴨病毒性肝炎病毒（DHV）引起的以雛鴨肝臟出血為特征的高致死率接觸性傳染病。現在普遍認為有三種不同的病毒與該病有關，分別是1型、2型和3型［1］。Kim報道了他們分離的5株DHV-1的全基因組序列，建議將其劃分為小RNA病毒科的一個新成員［2］。2005年，在“國際病毒分類委員會的第八次報告”中，已將2型DHV歸入星狀病毒科星狀病毒屬，命名為1型鴨星狀病毒［3］。Todd等通過對RT-PCR產物進行序列分析和同源性比較后發現，3型DHV也是一種星狀病毒［4］；但它有別于1型鴨星狀病毒，與2型火雞星狀病毒關系更為密切。1型和3型DHV之間沒有任何抗原相關性［5］。

其中，1型鴨病毒性肝炎呈世界性分布，流行于美國、英國、韓國、加拿大等國家［5，6］；而2、3型鴨病毒性肝炎病毒感染則具有明顯的地域性，2型感染僅見于英格蘭的東英地區，且自20世紀80年代中期暴發后，該地區也再未發生過［5，7］。至今，3型鴨病毒性肝炎主要在美國發生［5，8，9］。近年來，國內各地不斷出現免疫了DHV-1疫苗或者打了鴨病毒性肝炎卵黃抗體之后仍然發病的報道，人們懷疑可能是DHV-1變異株和新的血清型DHV感染所致。這些新型DHV目前被分為臺灣新型和韓國新型DHV［12］。不同血清型的DHV的基因分析結果表明，DHV-1和新型（臺灣新型和韓國新型）DHV位于小RNA病毒科中不同分支上。Wang等建議將血清1型、臺灣新型和韓國新型分為DHVA、B和C三種基因型。

近年來，隨著山東畜牧業的迅速發展，鴨的養殖量越來越多，而鴨病也變得異常復雜。在山東地區，許多鴨場在用了鴨病毒性肝炎疫苗或卵黃抗體以后依舊發病，而且傷亡嚴重，給養殖場/戶造成了嚴重的經濟損失。為了進一步了解近期鴨病毒性肝炎的流行情況、發病特點、發病原因及病原特征，制定相應的防治措施，我們對2014年4～8月份以來送診的疑似鴨病毒性肝炎臨床病例進行了流行病學、病理學、病毒學等系列化調查研究。

1　材料與方法

1.1實驗材料

鴨病毒性肝炎臨床疑似病例主要來自山東泰安及其周邊地區的發病肉鴨養殖場；病理組織學切片及染色在山東農業大學動科院生物切片室進行；DL5000 DNA Marker、無RNase雙蒸水，EasyPureTMViral DNA/RNA Kit購自北京全式金生物科技有限公司；EasyScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1病料采集對送診的疑似鴨病毒性肝炎病例進行病理學剖檢，對符合鴨病毒性肝炎病變的疑似病例，詳細記錄病死鴨信息，并進行編號。取腦、肝、脾、心臟等器官組織，分成兩份，一份用10%的福爾馬林溶液固定；另一份貯存于-80℃冰箱。

1.2.2組織病理學觀察將在10%福爾馬林溶液中固定好的組織經修塊、水沖、酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片流程制作常規石蠟切片，然后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察組織學病變。

1.2.3RNA提取及PCR鑒定取-80℃冰箱中保存的疑似鴨病毒性肝炎的病鴨組織，將各組織用勻漿機進行混合研磨，4000 rpm離心5 min，棄掉沉淀，取上層液體作為提取的樣本，并做相應的編號。按照EasyPureTMViral DNA/RNA Kit說明書的步驟進行RNA提取。參考張臣偉根據1型鴨病毒性肝炎VP0基因設計的引物：F：GCTCCAGACTAGTTCCTGAGG；R：CGGAGATCCAAGATGGCATA進行RT-PCR檢測，目的片段684 bp。20 μL體系組成如下：EasyScript One-Step Enzyme Mix 0.3 μL，2×One-Step Reaction Mix 10 μL，RNase-free Water 4.7 μL，上游引物F（10 μM）1 μL，下游引物R（10 μM）1 μL，模板3 μL，RT-PCR反應條件如下：42℃反轉錄25 min，95℃預變性5 min，然后進入30個循環（95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s），最后72℃延伸10 min。將PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.4序列測定及分析將鴨病毒性肝炎的陽性PCR產物送去華大基因進行測序，測序結果在DNAstar上與1型參考株（A、B、C型）進行比對，繪制遺傳進化樹及遺傳距離圖。

2　結果

2.1疑似病例癥狀表現及剖檢病變

病鴨精神沉郁，采食量減少，運動失調，死時呈角弓反張姿勢。病死鴨主要表現肝腫大，顏色變淺，表面有斑點狀出血。膽囊腫大，充滿墨綠色膽汁。腎腫大，充血呈鮮紅色，切面隆起，邊緣外翻。有些病例胰腺有局灶性壞死。有的病例還見心內外膜條紋狀出血病變。

2.2組織病理學病變

肝細胞普遍腫脹，呈空泡變性及脂肪變性病變，常見嚴重的出血性壞死，壞死肝細胞核碎裂、崩解，肝細胞溶解成均質紅染的顆粒狀物質，其中散在多少不等的紅細胞、淋巴細胞和異嗜性粒細胞。個別病例可見膽管上皮細胞、卵圓細胞、間質結締組織增生。脾臟、胰腺實質細胞表現不同程度的變性、壞死。腎小管上皮細胞普遍發生顆粒變性、水泡變性，并見不同程度的壞死，有的見許多異嗜性粒細胞浸潤。大部分病鴨可見輕度的病毒性腦炎病變，只有個別病例出現典型的袖套現象、小膠質細胞結節狀增生。

2.3PCR鑒定結果

2.3.1檢測結果對臨床上具有明顯的神經癥狀、剖檢肝臟出血的病例進行了PCR檢測。結果見表1，

10份病例中有7份為陽性，3份為陰性。

表1　DHV-1型鴨病毒性肝炎檢測結果Table 1 The test results of DHV-1

2.3.2PCR產物電泳結果10份PCR產物經過1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果發現有7份PCR產物在684 bp處有一條很亮的條帶，與預期的目的片段大小一致，為陽性；有3份PCR產物呈陰性（圖1）。

2.4VP0基因的遺傳進化分析

將7株DHV-1陽性PCR產物測序，與DHV-1經典代表株C80、A66，B型參考株04G、90D，C型參考株AP-03337、AP-04009、AP-04114、C-YCW、C-YCZ、C-YDF以及1型變異株1v等參考株進行序列比對，發現我們所獲得的7株分離株與韓國C型處在同一大的分支，親緣關系較近，從圖中可以看到，分離株與中國JS2010、C-YCW分離株處于較小的分支上，親緣關系最近，但為不同小分支，表明這些新型分離株與中國分離株JS2010、C-YCW存在一定差異性，與DHV-B、DHV-A處于不同的分支（圖2）。分離株的VP0基因序列表明，7株流行株（1、3、4、5、7、8、10號）之間的同源性在98.6%～100%（圖3），與韓國C型的同源性在95.4%～95.9%，與中國分離株C-YCW的同源性98.3%～98.9%，與臺灣型的同源性在74.8%～75.6%，與傳統1型A66的同源性僅為73.3%～73.8%。所以，分離的7株流行株均為DHV-C。

圖2　分離株與參考株的遺傳進化分析Fig.2 Evolutionary analysis on isolated and check strains

圖3　分離株與參考株的同源性分析Fig.3 Homologous analysis on isolates and check strains

3　討論

（1）新型鴨病毒性肝炎的臨床癥狀、剖檢病變以及組織病理學變化與經典的DVH基本相似，很難從這些方面對DHV的血清型進行鑒別診斷。

（2）從發病日齡上看，有的鴨群在27、30日齡時發病，與以往的經典鴨病毒性肝炎相比，發病日齡不僅僅局限在3～21日齡，有延遲的趨勢。

（3）10份具有肝臟出血、死后角弓反張癥狀的病例中，有3份為陰性，可能與黃曲霉素中毒或坦布蘇病毒感染有關，因為進一步檢測有些鴨飼料黃曲霉毒素嚴重超標，并檢測到鴨坦布蘇病毒感染。

（4）2002年，蘇敬良等從北京發病的北京雛鴨和廣西櫻桃谷病死鴨中分離到2株與1型鴨病毒性肝炎病毒無血清學相關性的病毒，將其暫定為新型鴨病毒性肝炎病毒（N-DHV）［10］。2006年，劉建等從北京、河北、山東和廣西等地送檢并具有明顯的肝臟出血病變特征的雛鴨肝臟中分離到9株病毒株，通過對其進行血清學鑒定，發現其中7株為新型鴨病毒性肝炎病毒，2株為1型鴨病毒性肝炎病毒［11］。本次的調查結果表明，山東省大多數地區由以前流行的經典DHV-A已經轉變成DHV-C，而多數疫苗或卵黃抗體是針對過去廣泛流行的DHV-A（如A66、C80等），這也解釋了用傳統的鴨病毒性肝炎弱毒疫苗或卵黃抗體無法預防該病的主要原因。

（5）雖然本次檢測到的鴨病毒性肝炎毒株均為DHV-C，但是并不代表山東省只存在該型鴨病毒性肝炎病毒，也可能存在經典鴨病毒性肝炎病毒。因為大多數肉鴨養殖場都使用A型鴨病毒性肝炎弱毒苗或者卵黃抗體，經典毒株已得到基本控制，DHV-C已成為優勢流行毒株。

（6）2008年，朱明霞等曾對淄博市8個區縣的218例鴨病毒性肝炎病例進行調查分析，結果發現，鴨群病毒性肝炎病占鴨發病數的42.5%，發病率為15.7%～22.7%，死亡率為11%～14%［13］；2012年，朱俊平等對濰坊地區22個鴨病毒性肝炎的鴨群進行調查發現，發病率3%～70.7%，病死率為8.6%～70.3%［14］。由上可見，目前，鴨病毒性肝炎仍然是危害鴨群的最主要疫病，經濟損失慘重，應該予以重視。

［1］Kim MC，Kwon YK，Joh SJ，et al.Recent Korean isolates of duck hepatitis of a new geno-and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strains，virus reveal the presence［J］.Arch Virol，2007，152：2059-2072

［2］Liu Ming，Meng Fanyi，Li Xiao-jun，et al.Goose haemorrhagic hepatitis caused by a new subtype duck hepatitis type 1 virus［J］.Veterinary Microbiology，2011，152：280-283

［3］Monroe SS，Carter MJ，Herrmann J，et al.Family Astroviridae//Fauquet CM，Mayo MA，Maniloff J，et al.Virus taxonomy. eighthreportoftheinternationalcommitteeontaxonomyofviruses［M］.London：Elsevier/AcademicPress，2005：859-864

［4］Todd D，Smyth VJ，Ball NW，et al.Identification of chicken enterovirus-like viruses，duck hepatitis virus type 2 and duck hepatitis virus type 3 as astroviruses［J］.Avian Pathol，2009，38（1）：21-29

［5］Saif YM.禽病學［M］.11版.蘇敬良，高福，索勛，譯.北京：中國農業出版社，2005：376-389

［6］郭玉璞，蔣金書.鴨病［M］.北京：北京農業大學出版社，1988：30-31

［7］Asplin FD.Duck hepatitis：vaccination against two serological type［J］.Vet Rec，1965，77（50）：1529-1530

［8］Levine PP，Fabricant J.A hitherto-undescribed virus disease of ducks in North America［J］.Cornell Vet，1950，40：71-86

［9］Toth TE.Studies of an agent causing mortality among ducklings immune to duck virus hepatitis［J］.Avian Dis，1969，13（4）：834-846

［10］蘇敬良，黃瑜，賀榮連，等.新型鴨病毒性肝炎病毒的分離及初步鑒定［J］.中國獸醫科技，2002，32（1）：15-16

［11］劉建，蘇敬良，張克新，等.新型鴨病毒性肝炎病毒流行病學調查及免疫防治試驗［J］.中國獸醫雜志，2006，42（2）：3-6

［12］韋天超，黃澤琳，蘭奉瑜，等.廣西新型鴨病毒性肝炎病毒分離鑒定及VP1基因研究初報［J］.廣西畜牧獸醫，2012，28（2）：98-99

［13］朱明霞，王桂英，牛鐘相，等.淄博地區鴨病毒性肝炎的流行病學調查［J］.動物醫學進展，2009，30（10）：59-62

［14］朱俊平，薛梅.山東省濰坊市鴨病毒性肝炎的流行病學調查［J］.中國動物檢疫，2014，31（12）：50-54

The Recent Investigation forthe Prevalence of DuckVirus Hepatitis in Peripheral Regions ofTai'an City

CHENG Zi-long1，WU Hai-bo2，YU Tao3，YUE Rui-chao1，LIU Si-dang1*
1.College of Animal Science and Technology/Shandong Agriculture University，Tai'an 271000，China
2.Shandong Dabao Breeding and Processing Co.ltd，Tai'an 271200，China
3.Veterinary Station of Xinpu Street in Xin'tai City，Xin'tai 271200，China

In the present study we investigated the prevalence and molecular characterization of Duck hepatitis virus in and around Tai'an area.From the suspected duck population we collected about 10 samples during the period of April to August 2014.Initially these samples were evaluated by necrscopsy，histopathological observation and RT-PCR findings.For further confirmatory studies these samples were subjected to genetic evaluation and homology analysis.The clinical symptoms and histopathological changes revealed that all the samples showed the presence of duck virus hepatitis.Out of the total samples seven were conformed for the presence of viral RNA by RT-PCR.The genetic evaluation and homology analysis of the positive sample on VP0 gene was 98.6%～100%，showed close similarities with previously reported Chinese isolates JS2010 and C-YCW homologies，98.3%-98.9%.Although these isolates having close phylogenetic relationship but still having some variation in the small branches，which suggested that the present isolates having certain difference from the previous isolates. It is clear that DHV isolate from all the positive samples having less than 76%similarity with DHV-A and DHV-B.Taken together，results suggest that DHV isolated from Shandong province of china is different from the early isolated DHV-A and DHV-B type and is conceder as a new DHV type（DHV-C）.Thus for the better control of this economically important disease in Shandong province，it is necessary to use the newly isolated strain for Vaccine preparation.

DVH；prevalence；new type

S858.32

A

1000-2324（2016）05-0674-04

2015-03-19

2015-04-08

山東省農業科技成果轉化資金項目：肉鴨重大疫病綜合監控技術集成與示范（20123082）

程子龍（1991-），男，山東聊城人，在讀碩士，研究方向為動物臨床病理學.E-mail：chengzilong2014@126.com

Author for correspondence.E-mail：liusid@sdau.edu.cn