響應面法優化普魯蘭多糖發酵工藝條件

戎蓉，歐杰

上海海洋大學食品學院，上海水產品加工與貯藏工程技術研究中心，上海201306

響應面法優化普魯蘭多糖發酵工藝條件

戎蓉，歐杰*

上海海洋大學食品學院，上海水產品加工與貯藏工程技術研究中心，上海201306

為了提高普魯蘭多糖的產量，本文利用響應面分析法對普魯蘭多糖的發酵工藝條件進行優化。在前期單因素實驗的基礎上，通過Plackett-Burmen實驗確定時間、轉速、初始pH為影響出芽短梗霉發酵產普魯蘭多糖的三個顯著因素。在此基礎上進行Box-Behnken實驗和響應面法分析來確定最佳的發酵條件。最終確定優化條件為溫度25℃，時間5.5 d，轉速240 r/min，初始pH 6.6，裝液量30 mL，接種量2%。優化后的普魯蘭多糖產量達到26.31 mg/mL，與預測值26.68 mg/mL接近，比初始產量16.13 mg/mL提高了63.1%。

響應面法；普魯蘭多糖；發酵工藝

普魯蘭多糖是由素有“黑酵母”之稱的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）經發酵產生的一種天然的、類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性粘質多糖［1］，它是先由葡萄糖按α-1，4糖苷鍵結合成麥芽三糖，在其兩端再以α-1，6糖苷鍵將麥芽三糖結合，如此反復連接而形成的一種線性高分子物質［2］。

我國在20世紀80年代左右開始對普魯蘭多糖進行研究，但由于出芽短梗霉細胞形態極其多樣化等條件的制約，目前對普魯蘭多糖的研究還存在諸多難題［3］。出芽短梗霉在其發酵過程中會進行許多變種，其可呈現酵母狀細胞，膨大細胞，厚垣孢子和菌絲等多種形態［4］，這些細胞合成有用代謝產物的能力有差異，而其發酵過程中的一些發酵條件如溫度、轉速、初始pH值、時間等等都在很大程度上影響這些細胞形態的轉化。Nishat Sharma等［5］人經研究表明出芽短梗霉的發酵溫度的變化值從25～30℃以及100 r/min到350 r/min之間不同的轉速值的變化對普魯蘭多糖產量的影響都較大。K.R. Sugumaran等［6］人經過研究表明在發酵過程中，前7天普魯蘭的多糖產量呈上升趨勢，而在之后繼續培養過程中產量則逐漸下降，在144 h產量達到最大值。孔維甲等人經過試驗表明在最適pH條件下，出芽短梗霉生長繁殖以酵母狀細胞或膨大細胞為主，而pH2.2或pH7.0時出芽短梗霉形成分生組織狀結構，使其具有不同的產普魯蘭多糖的能力［7］。在發酵過程中，發酵產量的高低由菌種的遺傳物質決定，發酵所需的營養成分提供給了菌種能發揮其性能的必要條件。但遺傳基因的表達也受到發酵條件的影響，發酵過程中的各種物理化學因素都會對菌種產生影響［8］。因此，對發酵過程中一些物理化學參數進行合理的調控是對于提高代謝產物的發酵產量的一個有利措施［9］。因此優化出較為合適的發酵條件是提高普魯蘭多糖產量的必要途徑。

目前國內外主要利用響應面法對發酵產普魯蘭多糖的培養基進行優化［10］，常帆等人利用響應面法優化出芽短梗霉As3.933產普魯蘭多糖的發酵培養基，使其產量從初始的17.32 mg/mL提高到22.29 mg/mL，提高了28.7%的產量［11］。而利用此方法對其發酵工藝條件進行優化選擇的較少。

本文就針對溫度、轉速、初始pH值、裝液量、時間、接種量這六個主要的發酵工藝條件進行Plackett-Burman實驗設計和響應面法分析，利用這種優化試驗條件的統計學方法，實現用較少的實驗數據推算出目標值的最優條件，最終有效提高優化效率［12，13］。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌種出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）：IFO4464購于上海市工業微生物研究所，由本實驗室保存于PDA斜面培養基上。

1.1.2培養基固體培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）

種子培養基（g/L）：蔗糖59.8、（NH4）2SO40.7、K2HPO45.0、MgSO40.3、NaCl1.5、KCl0.5酵母膏2.5、pH自然、1×105Pa滅菌20 min。

液體培養基（g/L）：蔗糖59.8、（NH4）2SO40.7、K2HPO45.0、MgSO40.3、NaCl1.5、KCl0.5酵母膏2.5、pH自然、1×105Pa滅菌20 min。

1.1.3儀器及設備滅菌鍋（上海博訊實業有限公司YXQ-LS-18SI），離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司H-2050R-1），振蕩培養箱（上海知楚儀器ZQLY-300），pH計（METTLER TOLEDO 320S）。

1.2分析方法

1.2.1總糖的測定培養一定時間后，于4500 r/min下離心20 min，然后取上清液加入2倍體積的無水乙醇，在4℃下靜置24 h，將沉淀物放于3000 r/min下離心10 min，用乙醇再洗，60℃下烘干至恒重，此為普魯蘭多糖粗品，用蒽酮比色法測量其中多糖的量［14］。

1.2.2Plackett-Burman實驗設計實驗在前期單因素實驗的基礎上，以普魯蘭多糖產量為響應值選用N=12的Plackett-Burman實驗設計對6種因子（溫度、轉速、初始pH值、裝液量、時間、接種量）進行考察，另外取5個虛擬項進行誤差估計。每個因子取2個水平，高水平編碼為+1，低水平編碼為-1。各因子水平取值見表1。用Design-Expert 8.0.6進行數據處理。

表1　Plackett-Burman實驗分析水平表Table 1 Values of coded levels used for the Plackett-Burman experimental design

1.2.3響應面分析實驗根據Box-Behnken實驗原理，用Design-Expert 8.0.6軟件，在Plackett-Burman實驗結果的基礎上進行三因素三水平實驗。

2　結果與分析

2.1Plackett-Burmen實驗

根據Plackett-Burmen實驗設計，按照N=12進行實驗。Plackett-Burmen實驗設計及響應值見表2，各因素效應值及顯著性分析見表3。

利用Design Expert 8.0.6軟件對Placktt-Burman設計的結果進行方差分析得出，對普魯蘭多糖產量產生顯著性影響的因素為時間、初始pH和轉速，其中時間和轉速為顯著正效應，初始pH值為顯著負效應，且根據表中的P值分析可知時間、初始pH和轉速的三因素的置信度均在90%以上，因此可將這三個因素作為下一步研究對象，其他因素定為非顯著因素，它們的取值則根據各因素效應的正負和大小，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值。

表2　Plackett-Burman實驗設計與結果Table 2 Design and results for the Plackett-Burman experiment

表3　因素效應值及顯著性分析Table 3 Values of effect size and analysis of significance for factors

2.2Box-Behnken實驗

通過以上Plackett-Burman實驗，確定了時間、初始pH和轉速為影響普魯蘭多糖產量的顯著因素。為了得到這三個因素對普魯蘭多糖發酵的確切影響情況及其最佳配比，下面需要利用Design-Expert 8.0.6軟件，使用Box-Behnken試驗方法對這三個因素進行考查。實驗因素水平的選取見表4，Box-Behnken實驗設計及結果見表5。

表4　Box-Behnken實驗因素與水平Table 4 Values of coded levels used for the Box-Behnken experimental design

表5　Box-Behnken實驗設計及結果Table 5 Design and results for the Box-Behnken experiment

用Design-Expert 8.0.6軟件對Box-Behnken實驗結果進行二次回歸分析，得到的回歸方程為：普魯蘭多糖產=29.61-1.49×A+1.91×B+2.86×C+3.89×A×B+0.065×A×C-0.42×B×C-2.72×A2-8.83×B2-5.93×C2。

由表6可知，根據該模型的F值和P值可得出該模型具有高度顯著性［Probability＞F）=0.0032］。模型的相關系數為R2=92.70%，說明該模型與實際實驗擬合的很好，能很好地預測普魯蘭多糖發酵條件與多糖產量的關系；而分析表B2、C2和C具有顯著性，其他項的系數均不顯著，說明試驗因子C在所選范圍內和二次項B2、C2對響應值都有很大關系，A、B在設定的范圍內對普魯蘭多糖產量的影響不顯著。校正決定系數（Adj R-Squared）為0.8330，說明該模型能解釋83.3%響應值的變化；而本模型的信噪比（Adeq Precision）為9.087，一般來說，模型的信噪比大于4就可以說明這個模型是比較好的，從而進一步說明該模型合理可靠。

表6　Box-Behnken試驗方差分析Table 6Analysis of variance for response surface quadratic model

根據Box-Behnken設計結果，利用Design-Expert 8.0.6軟件對模型進行響應面分析，得到響應面立體分析圖（圖1）。每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用。由圖可知，時間、初始pH和轉速與普魯蘭多糖的產量存在顯著相關性，其中時間和初始pH值對普魯蘭多糖產量的影響較為顯著。在一定范圍內，隨著時間的增加和初始pH的提高，普魯蘭多糖的產量明顯增加。但隨著時間和初始pH的進一步增加，普魯蘭多糖產量會有不同程度的下降。并且由相應的等高線圖可以看出，時間與初始pH的等高線圖接近圓形，交互作用是不顯著的，而時間與轉速、初始pH與轉速的等高線圖呈橢圓形，交互作用顯著。

圖1　響應面法分析AB為初始pH和轉速之間的相互作用；CD為時間和轉速之間的相互作用；EF為時間和初始pH之間的相互作用Fig.1 Response surface method for pullulan productionAB：The interaction between initial pH and speed；CD：The interaction between time and speed；EF：The interaction between time and initial pH

2.3最佳發酵條件的驗證

為了證實實驗結果的可靠性，對上述優化條件進行了驗證性實驗，進行3組平行實驗，結果測得普魯蘭多糖產量為26.31 mg/mL，與模型預測值一致（相對誤差0.99%）。

3　結論

通過對普魯蘭多糖發酵條件進行Plackett-Burman設計和響應面法分析，最終確定優化條件為溫度25℃，時間5.5 d，轉速240 r/min，初始pH 6.6，裝液量30 mL，接種量2%。優化后的普魯蘭多糖產量達到26.31 mg/mL，比初始產量16.13 mg/mL提高了63.1%。

4　討論

本實驗利用響應面分析法優化普魯蘭發酵工藝條件，實驗得出的預測結果與驗證實驗結果接近，具有很好的重現性，可見該模型可以較好的預測普魯蘭多糖實際發酵情況。并且考慮到各參數之間的相互影響，通過響應面優化將三個主要影響因素同時進行最佳條件的選擇，更加高效地達到優化的效果，使普魯蘭多糖的產量大幅上升達到26.31 mg/mL，該產量在已有研究報道中仍是具有優勢的數據，高于Jianxiong Kang［15］等人之前的研究報道中的產量。因此，采用響應面分析法優化普魯蘭多糖發酵工藝條件是行之有效的。

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Optimization of Fermentation Technological Conditions for Pullulan Production by Response Surface Method

RONG Rong，OU Jie*
College of Food Science and Technology/Shanghai Ocean University；Shanghai Aquatic Products Processing and Storage Engineering Technology Research Center，Shanghai 201306，China

To improve the Pullulan production，the response surface method（RSM）was used to optimize the fermentation technological conditions of pullulan producing strain in this study.On the basis of single factor tests，Plackett-Burmen experiment was employed with six factors and showed culture time，agitation speed and initial pH were three significant factors.Then the optimized technological conditions were obtained by Box-Behnken RSM.The optimum fermentation technological conditions were determined，namely，25℃culture temperature；5.5 d culture fermentation time；240 r/min culture agitation speed，initial pH 6.6，30 mL loaded liquid and 2%（V/V）inoculum concentration.Under these fermentation technological conditions，the predicted maximal pullulan production was 26.31 mg/mL which closed to the predicted value 26.68 mg/mL，it had increased by about 63.1%compared with the previous condition 16.13 mg/mL.

Response surface method；Pullulan；fermentation technology

Q939.97

A

1000-2324（2016）05-0659-05

2015-03-15

2015-04-27

上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）

戎蓉（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術.E-mail：1026989282@qq.com

Author for correspondence.E-mail：jou@shou.edu.cn