Paraconiothyrium variabile GHJ-4產漆酶發酵培養基優化及酶學性質研究

高繪菊，王鳳娟，王維樂，李偉慶，黃露，牟志美

山東農業大學林學院，山東泰安271018

Paraconiothyrium variabile GHJ-4產漆酶發酵培養基優化及酶學性質研究

高繪菊，王鳳娟，王維樂，李偉慶，黃露，牟志美*

山東農業大學林學院，山東泰安271018

為了提高木質素降解子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4產漆酶的能力，采用響應面分析法優化其產酶培養基。最優的發酵培養基組成為：麩皮30 g·L-1，可溶性淀粉58.08 g·L-1，牛肉浸膏3.39 g·L-1，NaNO31 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，CuSO40.554 g·L-1。采用該優化培養基，GHJ-4菌株的漆酶酶活達到410.04 U·mL-1，比優化前提高9.5倍。以愈創木酚為底物，該菌株純化漆酶的最適反應溫度為50°C，最適反應pH為5.0，米氏常數Km為62.07μmol·L-1，最大反應速度Vmax為68.97 mmol·（L·min）-1；該漆酶在55°C以下、pH3.5～6.5的范圍內較為穩定，Cu2+、Mg2+、Zn2+對漆酶酶活有明顯促進作用，而Hg2+、Fe3+、Ag+對漆酶酶活有顯著抑制作用。結果表明，Paraconiothyrium variabile GHJ-4是一株高效的漆酶產生菌株，具有潛在的工業化應用前景。

Paraconiothyrium variabile GHJ-4；漆酶；培養基優化；酶學性質

漆酶（Laccases，EC1.10.3.2）是一類可降解木質素的含銅多酚氧化酶，屬于藍色多銅氧化酶家族。自1883年日本學者吉田（Yoshida）首次發現漆酶以來，由于其對木質素或與木質素前體物質分子結構相似的許多環境污染物具有優良的降解性能，在林產品加工、生物制漿、紙漿漂白、污水處理、纖維改性、生物修復和生物燃料電池的陰極反應等方面顯示出良好的應用潛力［1-8］，一直是生物學、醫學、化學、環境污染治理等領域十分活躍的研究熱點，受到廣泛關注和高度重視。

目前，國內外報道的產漆酶菌株基本上都是擔子菌中的白腐菌［9］，對在自然界木質素降解過程中發揮不可忽視作用的子囊菌產漆酶的研究報道相對較少，且主要集中在青霉屬、鐮刀霉屬和曲霉屬的菌種。Paraconiothyrium sp.是Verkley等于2004年建立的一個新的木腐降解菌屬［10］，Damn等［11］依據所分離菌種的形態學特征、培養性狀和5.8 SrDNA序列等確立了該屬的新種—Paraconiothyrium variabile。Faramarzi等［12］利用該菌純化漆酶合成了Au納米粒子（AuNPs），Forootanfar等［13］發現該菌純化漆酶對孔雀綠、氨基黑、RB亮藍等合成染料具有較好的脫色效果，顯示了該子囊菌漆酶良好的應用前景，是一種極具研究價值和開發潛力的真菌漆酶。除此之外，國內外尚未見其它關于該菌株漆酶的研究報道。

Paraconiothyrium variabile GHJ-4是本實驗室從泰山腳下一腐朽柳木中分離到的一株子囊菌（GenBank注冊號為GQ331986）［14］。本研究以Paraconiothyrium variabile GHJ-4為發酵菌株，選擇培養基成分為自變量，以漆酶酶活為響應值，采用響應面法優化GHJ-4產漆酶的發酵培養基，同時研究其純化漆酶的酶學特性，以期為今后該菌株漆酶的工業化生產和應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種Paraconiothyrium variabile GHJ-4，由本實驗室從一腐朽柳木中分離獲得。

1.1.2培養基初始發酵培養基：麩皮30 g·L-1，蛋白胨2 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，VB10.02 g·L-1，CaCl20.01 g·L-1，1×105Pa滅菌30 min。

1.2試驗方法

1.2.1GHJ-4菌株的液體發酵將預培養4 d的GHJ-4菌株種子液按5%（V/V）接種量接種于50 mL初始發酵培養基中，28°C、150 r·min-1振蕩培養6 d，發酵液4°C、9500 r·min-1離心5 min，取上清用于酶活測定。

1.2.2漆酶酶活測定參照Gao等人［14］的方法，將每μmol/min愈創木酚被氧化所需酶量為l U。

1.2.3發酵培養基優化試驗設計在單因素分析的基礎上，選取可溶性淀粉（X1）、牛肉浸膏（X2）和CuSO4（X3）為響應面的自變量，建立以漆酶酶活（Y）為響應值的多元性回歸模型方程。利用Design-Expert 7.0和SAS 9.1.3統計分析軟件進行試驗設計與數據分析。

1.2.4漆酶的分離純化取發酵上清液加入80%飽和度的硫酸銨，4°C靜置過夜，離心棄上清，沉淀用少量緩沖液溶解，透析除鹽，然后進行DEAE-sepherose Fast Flow陰離子交換柱層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析，收集漆酶活性組分經SDS-PAGE檢測為單一條帶后，用于酶學性質的測定。

1.2.5漆酶的酶學性質測定

1.2.5.1最適反應溫度和熱穩定性的測定將酶液分別在25～90°C下測定酶活力，確定最適反應溫度。將酶液在25～90°C下保溫1 h，測定剩余酶活，以酶活最高者為100%計算相對酶活力。

1.2.5.2最適反應pH和pH穩定性的測定選用不同pH值的醋酸緩沖液作為緩沖體系，在50°C下測定酶活力，確定最適反應pH。將酶液加入不同pH值的醋酸緩沖液，常溫下維持1 h，測定剩余酶活，以酶活力最高者為100%計算相對酶活力。

1.2.5.3金屬離子對酶活力的影響在反應體系中分別加入不同的金屬離子，使其終濃度為5 mmol·L-1，測定酶活，以不加入金屬離子前的酶活作為100%計算相對酶活力。

1.2.5.4反應動力學參數的測定調節反應底物愈創木酚濃度范圍為0.05～2 mmol·L-1，在50°C、0.02 mol·L-1pH5.0的醋酸緩沖液中測定酶活力，根據Lineweaver-Burk作圖法，求取米氏常數Km和最大反應速度Vmax。

2　結果與分析

2.1中心組合試驗結果及響應面分析

采用3因素5水平的中心組合實驗設計（CCD）對影響GHJ-4產漆酶各因子進行了優化，試驗設計及結果見表1。利用Design Expert 7.0軟件對試驗數據進行響應面回歸分析，得到以漆酶酶活為響應值的多元回歸二次擬合模型：Y=405.44822+5.31052X1+6.5444X2+1.67431X3+7.50625X1X2-10. 57875X1X3-7.34875X2X3-16.65787X12-17.44269 X22-12.32854X32。

表1　中心組合試驗設計及其結果Table 1 Experimental design and results of central composite design

表2　回歸模型系數的顯著性檢驗Table 2 Significance test for regression coefficients

表3　回歸模型方差分析Table 3 ANOVA of quadratic polynomial model

回歸模型方差分析結果見表2、表3。模型Pr＜0.0001，說明在α=0.01水平上回歸極顯著；Pr失擬=0.9836，說明在α=0.1水平上失擬不顯著；復相關系數R2=0.9516，表明相關性很好，校正相關系數Adj R2=0.9081，說明模型可以解釋90.81%試驗所得漆酶酶活的變化，表明方程擬合較好。

由回歸方程所作出的響應面立體分析圖1顯示，X1、X2、X3存在極值點，利用SAS 9.1.3對Y進行分析，可以得到曲面的極大值，所對應的3個因子最優試驗點（X1、X2、X3）的代碼值（0.260、0.269、-0.127）。即培養基中可溶性淀粉為5.808%、牛肉浸膏為0.339%、CuSO4為0.0554%時，漆酶活力達到最高，預測值達407.57 U·mL-1。

圖1　可溶性淀粉、牛肉浸膏和CuSO4對漆酶產量交互影響的響應面圖Fig.1 Response surface plot of the mutual effect on laccase production versus soluble starch,beef extract and CuSO4

2.2驗證試驗

以2.1確定的主要因素濃度配制發酵培養基，分6次發酵，漆酶酶活分別為403.43、408.48、424.64、406.22、410.39、407.14 U·mL-1，平均酶活力為410.04 U·mL-1，約為發酵培養基優化前酶活（43.16 U·mL-1）的9.5倍。與模型預測值誤差＜1%，表明該模型能很好地預測實際發酵情況。

2.3GHJ-4漆酶的酶學性質

2.3.1最適反應溫度與熱穩定性分別在不同溫度下測定漆酶的酶活力，結果如圖2。漆酶作用的最適溫度為50°C，在45～60°C之間均有較高酶活力。將漆酶分別放在不同溫度下保溫1 h后測定酶活力，結果表明50°C以下漆酶相對穩定，酶活均在95%以上；50～65°C酶活性快速的下降；高于70°C保溫1 h后，酶活性基本上全部喪失。

圖2　GHJ-4漆酶的最適反應溫度和溫度穩定性Fig.2 The optimum temperature and the temperature stability of GHJ-4 laccase

2.3.2最適反應pH與pH穩定性分別在50°C、不同pH反應體系條件下測定GHJ-4漆酶的酶活力，結果如圖3所示。該漆酶最適反應pH為5.0，且在pH為3.5～7.0范圍內均有較高酶活力。pH4.5～5.5之間酶穩定性較好，酶活性可保持在80%以上，而當pH大于7.0時，漆酶活性迅速降低（圖3）。

圖3　GHJ-4漆酶的最適反應pH和pH穩定性Fig.3 The optimum pH and the pH stability of GHJ-4 laccase

2.3.3金屬離子對酶活的影響分別在pH 5.0、終濃度為5 mmol·L-1的各種金屬離子緩沖液中加入漆酶，反應30 min，測定酶活，結果如表4。Mg2+、Zn2+、Cu2+對該漆酶有激活作用；Li+、Ca2+、Ba2+、Hg2+、Fe3+、Ag+對酶活均有不同程度的抑制作用，其中Hg2+、Fe3+、Ag+對酶活影響最大，試驗中未檢測到酶活，K+、Na+對酶活影響最小。

表4　不同金屬離子對酶活的影響Table 4 Effect of metal ions on the activity of laccase

2.3.4漆酶的反應動力學參數在不同濃度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol·L-1的反應底物條件下，測定漆酶酶活力，分別以1/［S］和1/V為橫、縱坐標作Lineweaver-Burk圖，求得該漆酶催化愈創木酚的Km為62.07μmol·L-1，Vmax為68.97 mmol·（L·min）-1（圖4）。

圖4　以愈創木酚為底物的Lineweaver-Burk雙倒數作圖Fig.4 Lineweaver-Burk map-making using guaiacol as substrate

3　結論與討論

發酵培養基的優化是一種多因素多水平試驗，若采用單因素試驗和正交試驗工作量大且難以得到理想的結果。響應面分析法可以快速、有效地從影響產酶的因子中篩選出主要影響因素，避免非主要因素可能造成的時間和資源的浪費，并且可實現條件優化，該統計學方法已被成功的應用于白腐菌漆酶發酵培養基的優化［15-19］。本文將Plackett－Burman設計與響應面分析法相結合，優化得出木質素降解子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4產漆酶的最佳發酵培養基配方為：麩皮30 g·L-1，可溶性淀粉58.08 g·L-1，牛肉浸膏3.39 g·L-1，NaNO31 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，CuSO40.554 g·L-1。在此優化培養基下經搖瓶培養試驗驗證，酶活力的平均值為410.04 U·mL-1，與預測值407.57 U·mL-1之間誤差小于1%，說明預測模型可靠性高，表明響應面法優化發酵培養基也是提高子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4漆酶酶活力的有效途徑之一，研究結果為該菌株漆酶的繼續擴大培養和最佳生產發酵工藝的確定奠定了基礎。

多數白腐菌漆酶的最適反應溫度在30～60°C，最適反應pH在4～6之間。本文試驗結果表明，GHJ-4純化漆酶的最適反應溫度和pH分別為50°C和5.0，該酶在55°C以下、pH4.5～5.5范圍內較為穩定；Cu2+、Mg2+、Zn2+對酶活有激活作用，而Hg2+、Fe3+、Ag+對酶活有顯著抑制作用。以愈創木酚為底物時，該酶的Km為62.07μmol·L-1，Vmax為68.97 mmol·（L·min）-1，與大多數白腐菌漆酶的酶學性質基本一致［20-22］。該研究結果不僅為今后Paraconiothyrium variabile GHJ-4漆酶的工業化應用提供了重要的理論依據，也為利用基因工程手段構建高效表達GHJ-4漆酶的基因工程菌提供了可能，同時還可以進行GHJ-4漆酶的蛋白質工程研究，使漆酶獲得某些新的理化性質，以滿足不同的工業化生產和應用需求，相關研究正在進行中。

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Medium Optimization and Characterization of Laccase Production by Paraconiothyrium variabile GHJ-4

GAOHui-ju，WANGFeng-juan，WANGWei-le，LIWei-qing，HUANGLu，MUZhi-mei*
College of Forestry/Shandong Agricultural Univesity，Taian 271018，China

In order to enhance laccase production in Paraconiothyrium variabile GHJ-4，the fermentation medium for laccase production was optimized by response surface methodology.The optimal medium components were as follows（g·L-1）：wheat bran 30，soluble starch 58.08，beef extract 3.39，NaNO31，KH2PO43，CuSO40.554.Using this optimized fermentation method，the activity of laccase increased 9.5 times at 410.04 U·mL-1compared with the laccase production with an unoptimized medium.The optimum temperature and pH of the purified Laccase were 60°C and 2.6，respectively in catalytic reaction of oxidizing guaiacol.Kmvalues and Vmaxvalues of the enzyme for guaiacol were 62.07μmol·L-1and 68.97 mmol·（L·min）-1.The enzyme activity was stable under 55°C and pH 3.5-6.5.The activity of enzyme was enhanced by the metal ions Cu2+，Mg2+and Zn2+；whereas it was inhibited by Hg2+，Fe3+and Ag+.The results showed that Paraconiothyrium variabile GHJ-4 was highly-efficient laccase-producing fungi and had good industrial application prospects.

Paraconiothyrium variabile GHJ-4；laccase；medium optimization；enzyme characterization

S718.81

A

1000-2324（2016）05-0641-06

2015-04-15

2015-04-20

國家自然科學基金項目（31200450）；中國博士后科學基金項目（2013M541944）；山東省現代農業產業技術體系蠶桑產業創新團隊建設資助項目（SDAIT-18-05）

高繪菊（1975-），女，副教授，主要從事應用微生物研究.E-mail：ghj@sdau.edu.cn

Author for correspondence.E-mail：zmeimu@sdau.edu.cn