兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤Klf4表達(dá)及其影響因素研究

朱秀麗，曲 凡，李美楠，鄭 鈺，陳 健，張文婷

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·論著·

兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤Klf4表達(dá)及其影響因素研究

朱秀麗，曲 凡，李美楠，鄭 鈺，陳 健，張文婷

目的探討兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)Klf4表達(dá)情況及其影響因素。方法選取2007年1月—2013年3月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院兒科治療的NB患兒33例為病例組，另選取同期本院嚴(yán)重腎盂積水患兒10例為對(duì)照組。記錄兩組患兒臨床資料，取病例組病理組織，對(duì)照組殘余的正常腎上腺組織，采用免疫組化SP法檢測(cè)Klf4表達(dá)情況，根據(jù)染色強(qiáng)度和Klf4陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)價(jià)Klf4表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果病例組Klf4表達(dá)陽(yáng)性10例(30.3%)，對(duì)照組Klf4表達(dá)陽(yáng)性9例(9/10)，病例組Klf4表達(dá)陽(yáng)性率低于對(duì)照組(χ2=8.801，P=0.003)。病例組不同性別、年齡、病理分期患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率高于神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒，術(shù)前化療患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率高于術(shù)前未化療患兒(P<0.05)。結(jié)論NB患兒Klf4表達(dá)下降，且與NB分型有關(guān)，術(shù)前化療藥物可能對(duì)Klf4的表達(dá)產(chǎn)生影響。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤；Klf4；兒童

朱秀麗，曲凡，李美楠，等.兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤Klf4表達(dá)及其影響因素研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(30)：3694-3697.[www.chinagp.net]

ZHU X L,QU F，LI M N,et al.Expression and influence factors of Klf4 among children with neuroblastoma[J].Chinese General Practice，2016，19(30)：3694-3697.

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)是兒童最常見的顱外實(shí)體腫瘤，占兒童腫瘤的7%～10%[1]。NB惡性程度高，易早期轉(zhuǎn)移，多數(shù)患兒就診時(shí)已達(dá)中晚期。化療是NB的主要治療手段，治療過(guò)程中易出現(xiàn)化療耐藥和復(fù)發(fā)，治療效果差，預(yù)后不良。目前，隨著對(duì)腫瘤的不斷深入研究，有學(xué)者提出腫瘤干細(xì)胞(TSCs)的概念，并認(rèn)為TSCs在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、化療耐藥及復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用，其特性決定腫瘤治療的敏感性和結(jié)局[2]。Klf4為胚胎性干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，是調(diào)控胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因子，在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中對(duì)維持胚胎干細(xì)胞多潛能性和自我更新能力具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用，并且對(duì)于維持TSCs的特性也發(fā)揮重要作用[3]。目前，Klf4在NB中作用的研究報(bào)道較少。本研究旨在通過(guò)觀察干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Klf4在NB中的表達(dá)，分析其與患兒臨床病程、病理類型的關(guān)系，探索其在NB發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的作用，為臨床NB的診治提供參考。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2007年1月—2013年3月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院兒科治療的NB患兒33例為病例組，其中男21例，女12例；年齡1～9歲，中位年齡5(3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)組織學(xué)及免疫表型特點(diǎn)，經(jīng)手術(shù)切除或活檢病理檢查證實(shí)為NB；(2)年齡<14歲；(3)臨床資料完整，病理標(biāo)本能夠滿足本研究需要。

1.2方法

1.2.1資料收集記錄兩組患兒性別、年齡、疾病分型、病理分期及術(shù)前是否化療。

1.2.2Klf4表達(dá)檢測(cè)Klf4兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Prosci Incorporated公司，按1∶100稀釋；免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。取病例組病理組織標(biāo)本，對(duì)照組殘余的正常腎上腺組織標(biāo)本。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，依次經(jīng)固定、脫水、熱抗原修復(fù)、過(guò)氧化酶活性阻斷、封閉抗原、一抗及二抗孵育、顯色、復(fù)染、封固處理，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照，選擇實(shí)驗(yàn)獲得陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。Klf4染色陽(yáng)性部位位于NB細(xì)胞質(zhì)，根據(jù)染色強(qiáng)度分為:0分(無(wú)色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)。根據(jù)Klf4陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比分為0分(陰性)、l分(陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比≤10%)、2分(陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為11%～50%)、3分(陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為51%～75%)、4分(陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比≥76%)。以兩者評(píng)分乘積將Klf4表達(dá)強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：陰性(0～2分)、弱陽(yáng)性(3～4分)、中度陽(yáng)性(5～8分)、強(qiáng)陽(yáng)性(9～12分)[1]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(QR)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組Klf4表達(dá)陽(yáng)性率比較病例組Klf4表達(dá)陽(yáng)性10例(30.3%)，對(duì)照組Klf4表達(dá)陽(yáng)性9例(9/10)，病例組Klf4表達(dá)陽(yáng)性率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.801，P=0.003，見圖1，本文彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net相應(yīng)文章附件)。

2.2病例組不同臨床特征患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率比較病例組不同性別、年齡、病理分期患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率高于NB患兒，術(shù)前化療患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率高于術(shù)前未化療患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

注：A示Klf4在病例組神經(jīng)母細(xì)胞瘤中呈中度陽(yáng)性表達(dá)，B示Klf4在病例組神經(jīng)母細(xì)胞瘤中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，C示Klf4在病例組神經(jīng)母細(xì)胞瘤中呈陰性表達(dá)，D示Klf4在對(duì)照組中呈中度陽(yáng)性表達(dá)

圖1兩組Klf4的表達(dá)(SP染色，×200)

Figure 1Expression of Klf4 in two groups

表1病例組不同臨床特征患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率比較〔n(%)，N=33〕

Table 1Comparison of the positive rate of Klf4 expression among different clinical features in case group

臨床特征例數(shù)陽(yáng)性陰性P值性別0.433 男215(23.8)16(76.2) 女125(41.7)7(58.3)年齡(歲)1.000 ≤5185(27.8)13(72.2) >5155(33.3)10(66.7)疾病分型0.010 節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤96(6/9)3(3/9) NB244(16.7)20(83.3)病理分期0.444 Ⅲ期104(4/10)6(6/10) Ⅳ期236(26.1)17(73.9)術(shù)前化療<0.001 是139(69.2)4(30.8) 否201(5.0)19(95.0)

注：NB=神經(jīng)母細(xì)胞瘤

3　討論

Klf4是Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，因其常表達(dá)于胃腸道上皮細(xì)胞，故又稱胃腸富集Kruppel樣因子。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員的共同特點(diǎn)是具有多個(gè)串聯(lián)型的C2H2(Cys2-His2)鋅指樣結(jié)構(gòu)，能夠識(shí)別并特異性結(jié)合在富含GC的序列上。人類Klf4基因位于染色體9q31，長(zhǎng)5 631 bp，有5個(gè)外顯子，編碼513個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為54 671。Klf4在人體內(nèi)多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與多種生理功能，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、維持干細(xì)胞的全能性等[4-7]。作為抑癌基因或癌基因，Klf4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮完全不同的作用。如Klf4可維持乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮癌基因作用[8]。而在非霍奇金及經(jīng)典霍奇金淋巴瘤中則發(fā)揮抑癌基因的作用，GUAN等[9]研究顯示，在伯基特淋巴瘤細(xì)胞系中，Klf4可阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期處于G0/G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)其凋亡。

本研究顯示，病例組Klf4表達(dá)陽(yáng)性率低于對(duì)照組，提示Klf4在NB發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮抑癌基因作用。研究發(fā)現(xiàn)，Klf4在同種腫瘤中可發(fā)揮癌基因和抑癌基因兩種完全相反的作用：如WEI等[10]研究認(rèn)為，Klf4在胰腺癌中發(fā)揮癌基因的作用，并且Klf4表達(dá)上調(diào)能夠?qū)е乱认侔┗颊叩纳鏁r(shí)間縮短；而ZAMMARCHI等[11]研究顯示，在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌中，基因組的缺失導(dǎo)致了Klf4的表達(dá)缺失，Klf4基因修復(fù)可抑制癌細(xì)胞的增殖，說(shuō)明Klf4在胰腺癌發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因的作用。在針對(duì)前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，前列腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤變組織及前列腺正常組織Klf4表達(dá)水平依次降低，提示Klf4可能發(fā)揮了癌基因的作用[12]。而WANG等[3]研究則顯示，在前列腺癌細(xì)胞株Dupro和PC-3中，Klf4發(fā)揮抑癌基因作用，恢復(fù)Klf4的表達(dá)，可使細(xì)胞周期停滯于G2/M期，并且伴有cyclinB基因表達(dá)下調(diào)，提示Klf4基因可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白使細(xì)胞周期停滯于G2/M期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。SHUM等[13]研究證實(shí)，但Klf4在NB中也發(fā)揮著抑癌基因的作用。但Klf4既可以作為癌基因，又可以作為抑癌基因的具體機(jī)制尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，病例組節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率高于NB患兒，提示Klf4表達(dá)水平與疾病分型相關(guān)。SHUM等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Klf4過(guò)表達(dá)可使NB細(xì)胞失去神經(jīng)母細(xì)胞的表型，而出現(xiàn)非致瘤性的平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志。FEINBERG等[14]在白血病細(xì)胞HL-60中也發(fā)現(xiàn)，敲除Klf4可抑制佛波酯所誘導(dǎo)的單核細(xì)胞分化，而Klf4過(guò)表達(dá)可使HL-60表現(xiàn)出成熟的單核細(xì)胞特征，因此筆者認(rèn)為Klf4是單核細(xì)胞分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)節(jié)因子。Klf4低表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)，可能成為判斷預(yù)后的指標(biāo)。在未來(lái)的研究中，可通過(guò)嘗試上調(diào)Klf4表達(dá)，誘導(dǎo)NB向分化良好的類型轉(zhuǎn)化，降低NB的惡性程度，改善患者預(yù)后。

本研究發(fā)現(xiàn)，病例組術(shù)前化療患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率高于術(shù)前未化療患兒，提示化療藥物的使用可上調(diào)Klf4的表達(dá)。MOHAN等[15]研究顯示，Klf4在惡性NB細(xì)胞系中發(fā)揮腫瘤抑制因子作用，可通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)的表達(dá)，增強(qiáng)芹黃素對(duì)于惡性NB的抗癌作用。因此，上調(diào)Klf4表達(dá)的化療藥物在NB治療中可能獲得更好的療效。本研究未發(fā)現(xiàn)不同性別、年齡、病理分期的NB患兒Klf4表達(dá)陽(yáng)性率間存在差異。

綜上所述，NB患兒Klf4表達(dá)下降，且與NB分型有關(guān)，術(shù)前化療藥物可能對(duì)Klf4的表達(dá)產(chǎn)生影響。本研究納入的NB患兒均為中晚期(Ⅲ～Ⅳ期)，未能與NB早期(Ⅰ～Ⅱ期)患兒的Klf4表達(dá)陽(yáng)性率比較，故結(jié)果尚存在一定的局限性。

作者貢獻(xiàn)：朱秀麗進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；李美楠進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、評(píng)估、資料收集整理；鄭鈺、陳健、張文婷協(xié)助收集資料；曲凡進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Expression and Influence Factors of Klf4 among Children with Neuroblastoma

ZHUXiu-li,QUFan，LIMei-nan,ZHENGYu,CHENJian,ZHANGWen-ting.

DepartmentofPediatrics,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

Correspondingauthor:QUFan，DepartmentofPediatrics,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China；E-mail：13831128697@163.com

ObjectiveTo explore the expression and influence factors of Klf4 among children with neuroblastoma(NB).Methods33 children with NB who were treated in Department of Pediatrics of the Fourth Hospital of Hebei Medical University from January 2007 to March 2013,were selected as the case group,and 10 children with serious hydronephrosis in this hospital during the same period,were selected as the control group.The clinical data of two groups of children were recorded,the pathological tissues of the case group and the residual normal adrenal tissues of the control group were used as study subjects,the method of immunohistochemical SP was used to detect Klf4 expression.The expression intensity of Klf4 was evaluated according to the staining intensity and the percentage of Klf4 positive cells.Results10 cases(30.3%) in the case group had positive expression of Klf4,and 9 cases(9/10) in the control group had positive expression of Klf4,and the positive rate of Klf4 expression in the case group was significantly lower than that in the control group(χ2=8.801，P=0.003).In the case group,there was no significant difference in the positive rate of Klf4 expression among children with different sex,age and pathological stages(P>0.05).In the case group,the positive rate of Klf4 expression among children with ganglioneuroblastoma was significantly higher than that among children with neuroblastoma,and the positive rate of Klf4 expression among children who underwent preoperative chemotherapy was significantly higher than that among children who did not underwent preoperative chemotherapy(P<0.05).ConclusionThe level of Klf4 expression among children with NB is low,and level of Klf4 expression is related to NB classification.Preoperative chemotherapy drugs may influence the expression of Klf4.

Neuroblastoma；Klf4；Child

050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院兒科(朱秀麗，曲凡，鄭鈺，陳健，張文婷)；承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科(李美楠)

曲凡，050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院兒科；E-mail：13831128697@163.com

R 730.264

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.30.011

2016-03-20；

2016-07-18)