凡德他尼衍生物的設計、合成與體外抗腫瘤活性

張芮，夏桂民，呂凱，柳珊，張俊，劉明亮

凡德他尼衍生物的設計、合成與體外抗腫瘤活性

張芮，夏桂民，呂凱，柳珊，張俊，劉明亮

目的 設計合成凡德他尼衍生物，并評價其體外抗腫瘤活性。

方法 4-（2-氟-4-溴）苯胺基喹唑啉母核化合物（由 7-芐氧基-6-甲氧基喹唑啉-4-醇合成）與含有肟基的哌啶類化合物（由N-Boc-3/4-哌啶酮合成）通過縮合反應制備目標物，其結構經1H-NMR、13C-NMR、MS 和 HRMS 確證。SRB 法測定所有目標物（30 μmol/L）對肺癌細胞 A549 的抑制率，進一步測定抑制率大于 65% 的目標物對 4 種腫瘤細胞A549、HT29、K562、KB 的 IC50值。

結果 合成了 20 個全新結構的凡德他尼衍生物。7 個目標物對 A549 的抑制率大于 65%，其中化合物 15b1 和 16b2對 A549 的 IC50分別為 1.94 和 0.26 μmol/L，化合物15b2 對口腔表皮癌細胞 KB 的 IC50為 4.83 μmol/L，優于或相當于凡德他尼。

結論 豐富了凡德他尼 7-位取代基的結構類型，目標物16b2 對 A549 的活性是凡德他尼的 6 倍以上，值得進一步研究。

化學技術，合成； 抗代謝藥，抗腫瘤； 凡德他尼衍生物

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2016, 11(5):432-436

癌癥是僅次于心血管疾病的人類死亡的第二大原因［1］。作為一類重要的靶向抗腫瘤藥物，小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑（TKI）目前已廣泛應用于臨床。其中 4-氨基喹唑啉類化合物令人關注，已有多個藥物被美國 FDA 批準上市，更多的候選物則處于臨床或臨床前研究［2-7］。

4-氨基喹唑啉骨架的結構改造主要集中在4 位和 7 位，并取得了很大進展［5］。凡德他尼（vandetanib，圖 1）、吉非替尼、埃克替尼、厄洛替尼等均是通過對這兩個位置改造而獲得的優秀抗腫瘤藥物［8-10］。近年研究發現， 向母核 7 位引入堿性基團有利于這類化合物的理化性質、藥代動力學性質、選擇性及活性。其中 7 位含有 N-甲基哌啶片段的凡德他尼是第一個被 FDA 批準（2011 年）上市的用于治療甲狀腺髓樣癌（MTC）的 TKI，其對其他實體瘤的研究目前正處于 I ～ III期臨床階段。

圖1 4-氨基喹唑啉骨架和凡德他尼的結構Figure 1 Structure of vandetanib

甲肟基是第三、四代頭孢菌素結構中的常見基團，將其引入喹諾酮 7 位堿性含氮雜環片段中可明顯改善藥代動力學性質和（或）生物活性（如吉米沙星，IMB-070593）［11-12］。借鑒這一成功的設計策略，作者擬向凡德他尼的哌啶環片段中引入肟基，同時改變哌啶環與氧原子之間的碳鏈長度，設計合成了一系列凡德他尼衍生物，并對其活性進行初步評價，以期獲得抗腫瘤活性更強的化合物，為進一步研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 梅特勒 MP-70 熔點儀為瑞士梅特勒-托利多公司產品；Advion Mass Express 2.1.243 和 Micromass Autospec Ultima-Tof 型質譜儀分別為美國 Advion 公司和美國Waters公司產品；Mercury-400 MHz 和 Inova-500 MHz 型核磁共振儀為美國 Varian 公司產品。

1.1.2 主要試劑 色譜用薄層層析硅膠 H 為青島海洋化工廠產品；其他試劑和溶劑均為市售化學純或分析純，根據需要經無水干燥處理后使用。

1.2 方法

1.2.1 化學合成 N-Boc-4-哌啶酮（1）和N-Boc-3-哌啶酮（2）依次經與甲/乙/芐氧胺或羥胺肟化和脫保護基（Boc）分別得 4-肟基哌啶（3a-d）和 3-肟基哌啶（4a-d）［13］。原料 1 分別經 PhI（OAc）2氧化及水解得 5，水解產物 5 與甲/乙/芐氧胺肟化得 6a-c，再磺酰化得甲磺酸酯（7a-c）［14-15］（圖 2）。

國內有商品供應的 7-芐氧基-6-甲氧基喹唑啉-4-醇（8）與氯化亞砜反應得 9，進一步和 2-氟-4-溴苯胺反應得 10，再氫化脫芐基得 4-（2-氟-4-溴）苯胺基喹唑啉（11）。關鍵中間體 11 與 1-氯-2-溴乙烷或 1-氯-3-溴丙烷發生親核取代反應得 12 和13 后與 3a-d 和 4a-d 縮合分別得目標物 15a-d和 16a-d。11 與羥基活化的 7a-c 縮合得 14a-c 后脫 Boc 即得目標物 17a1-c1。其中 17a1、b1 經埃施魏勒-克拉克反應（Eschweiler-Clarke reaction）得相應的甲基化目標物 17a2、b2（圖 3）［8］。

圖2 哌啶類化合物 3（4）a-d 和 7a-c 的合成Figure 2 Synthesis of piperidines 3（4）a-d and 7a-c

圖3 目標化合物 15 ～ 17 的合成Figure 3 Synthesis of target compounds 15 - 17

1.2.2 SRB 法測定體外抗腫瘤活性 取腫瘤細胞至 96 孔板中，使每孔中的細胞數在 4000 ～ 8000之間，置 37 ℃，5% CO2中培養 24 h。加入 5 個濃度梯度的目標化合物，設立 3 ～ 4 個復孔，繼續培養 48 h，貼壁細胞經 4 ℃ 預冷的 50% 三氯乙酸（TCA）固定，96 孔板置于 4 ℃ 冰箱放置 1 h，用蒸餾水洗滌細胞孔 5 次。待細胞板晾干后，用0.4% 的磺酰羅丹明 B（SRB）染色 15 ～ 30 h，1%的乙酸洗滌 5 次，晾干。加入 10 mmol/L Tris 溶液 150 μl 溶解，低速振蕩 5 ～ 10 min，用酶聯免疫檢測儀在波長 490 nm 處測定吸收值，并根據以下公式計算抑制率。

根據藥物濃度與相應的抑制率作圖，計算 IC50。

2 結果

2.1 目標化合物的合成

共合成目標化合物 20 個，其結構（圖 4）均經1H-NMR 和 MS 確證，部分化合物還經13C-NMR 和 HRMS 進一步確證。

2.2 體外抗腫瘤活性

利用 SRB 法測定目標化合物 15 ～ 17 在30 μmol/L 濃度下對肺癌細胞 A549 的抑制率，結果見表 1。除化合物 15b2 的抑制率（98.93%）與對照藥凡德他尼基本相當外，余者均弱于后者。

表1 目標化合物 15 ～ 17 的結構及對 A549 的抑制率Table 1 inhibition rate of target compounds 15 - 17

選取表 1 中對 A549 抑制率大于 65% 的目標化合物 15a1/2、15b1/2、16a1、16b2、17c1，進一步評價其對 4 種腫瘤細胞 A549、結腸癌HT29、骨髓癌 K562 和口腔表皮癌 KB 的 IC50值。結果顯示，這 7 個化合物均有不同的體外抗腫瘤活性（表 2）。盡管這些結果大多不如預期，但化合物 15b1 和 16b2 對 A549 的活性（IC50分別為 1.94 和 0.26 μmol/L）以及化合物 15b2 對KB 的活性（IC50為 4.83 μmol/L）優于或相當于凡德他尼，令人關注。

3 討論

近年來，多個 TKI 相繼問世并廣泛用于臨床治療各種癌癥，但其選擇性及逐年增加的耐藥性等仍是今后該領域研究的重點。與其他類藥物的研究相似，發現和開發具有全新結構骨架和（或）作用機制的 TKI 無疑是解決上述問題的根本策略，但對已知 TKI 的結構改造則不失為一條更加現實的途徑。

表2 目標化合物的體外抗腫瘤活性Table 2 In vitro activity of selected compounds against 4 cell lines

作者借鑒本課題組在喹諾酮類新化合物設計中的成功經驗，將肟基引入凡德他尼 7-位哌啶環片段中，設計合成了一系列結構新穎的凡德他尼衍生物。由體外活性數據可見：①目標化合物的構-效關系（SAR）難以總結（即使是對某 1 株細胞系）；②活性結果大多不如人意，但部分化合物對個別腫瘤細胞仍表現出明顯的體外活性。③凡德他尼被認為“有希望成為抗擊非小細胞肺癌的特效藥”［16］，而化合物 16b2 對 A549 的活性是凡德他尼的6 倍以上，故極有必要深入研究。為此，我們即將展開對化合物 16b2 的初步毒性研究及其對 A549的體內活性評價，其結果值得期待。

［1］ Lv K， Wang LL， Liu ML， et al. Synthesis and in vitro antitumor activity of 1-（3-dimethylamino）propylindolin-2-one derivatives. Med Chem Res， 2013， 22（4）：1723-1729.

［2］ Plé PA， Green TP， Hennequin LF， et al. Discovery of a new class of anilinoquinazoline inhibitors with high affinity and specificity for the tyrosine kinase domain of c-Src. J Med Chem， 2004， 47（4）：871-887.

［3］ Straw LM， Shawver LK. Tyrosine kinases in disease： overview of kinase inhibitors as therapeutic agents and current drugs in clinical trials. Exp Opin Invest Drugs， 1998， 7（4）：553-573.

［4］ Wang M， Ye C， Liu M， et al. Synthesis and antitumor activity of 5-（5-halogenated-2-oxo-1H-pyrrolo［2，3-b］pyridin-（3Z）-ylidenemethyl）-2，4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamides. Bioorg Med Chem Lett，2015， 25（14）：2782-2787.

［5］ Li RD， Zhang X， Li QY， et al. Novel EGFR inhibitors prepared by combination of dithiocarbamic acid esters and 4-anilinoquinazolines. Bioorg Med Chem Lett， 2011， 21（12）：3637-3640.

［6］ Patel R， Leung HY. Targeting the EGFR-family for therapy： biological challenges and clinical perspective. Curr Pharm Des， 2012， 18（19）：2672-2679.

［7］ Cheng W， Zhu S， Ma X， et al. Design， synthesis and biological evaluation of 6-（nitroimidazole-1H-alkyloxyl）-4-anilinoquinazolinesas efficient EGFR inhibitors exerting cytotoxic effects both under normoxia and hypoxia. Eur J Med Chem， 2015， 89：826-834.

［8］ Hennequin LF， Stokes ES， Thomas AP， et al. Novel 4-anilinoquinazolines with C-7 basic side chains： design and structure activity relationship of a series of potent， orally active， VEGF receptor tyrosine kinase inhibitors. J Med Chem， 2002， 45（6）：1300-1312.

［9］ Commander H， Whiteside G， Perry C. Vandetanib： first global approval. Drugs， 2011， 71（10）：1355-1365.

［10］ Gule MK， Chen Y， Sano D， et al. Targeted therapy of VEGFR2 and EGFR significantly inhibits growth of anaplastic thyroid cancer in an orthotopic murine model. Clin Cancer Res， 2011， 17（8）：2281-2291.

［11］ Hong CY， Kim YK， Chang JH， et al. Novel fluoroquinolone antibacterial agents containing oxime-substituted （aminomethyl）pyrrolidines： synthesis and antibacterial activity of 7-（4-（aminomethyl）-3-（methoxyimino）pyrrolidin-1-yl）-1-cyclopropyl-6- fluoro-4-oxo-1，4-dihydro［1，8］naphthyridine-3-carboxylic acid （LB20304）. J Med Chem，1997， 40（22）：3584-3593.

［12］ Wang XY， Guo Q， Wang YC， et al. Synthesis and antibacterial activity of 7-（3-amino-4-alkoxyimino-1-piperidyl）-quinolones. Acta Pharm Sinica， 2008， 43（8）：819-827. （in Chinese）王秀云， 郭強， 王玉成， 等. 7-（3-氨基-4-烷氧亞胺基-1-哌啶基）喹諾酮類化合物的合成與抗菌作用. 藥學學報， 2008， 43（8）：819-827.

［13］ Huang J， Liu H， Liu M， et al. Synthesis， antimycobacterial and antibacterial activity of l-［（1R，2S）-2-fluorocyclopropyl］naphthyridone derivatives containing an oxime-functionalized pyrrolidine moiety. Bioorg Med Chem Lett， 2015， 25（22）：5058-5063.

［14］ Wang JX， Guo Q， Chai Y， et al. Synthesis and in vitro antibacterial activities of 7-（4-alkoxyimino-3-hydroxypiperidin-1-y1）quinolone derivatives. Chin Chem Lett， 2010， 21（1）：55-58.

［15］ Tomio K， Naoki T， Hiroyuki K， et al. Cyclic amine derivative having substituted alkyl group： US， 2009306059. 2009-12-10.

［16］ Peng Y， Zhang YX， Zheng GX. Progress of research on the new protein tyrosine kinase inhibitor antitumor drugs. J Shenyang Pharml Univ， 2007， 24（7）：451-456. （in Chinese）彭珧， 張怡軒， 鄭更新. 新型蛋白酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物的研究進展. 沈陽藥科大學學報， 2007， 24（7）：451-456.

Objective To design and synthesize a series of novel vandetanib derivatives， and evaluate their in vitro antitumor activity.

Methods Title compounds were synthesized through the condensation of 4-（（4-bromo-2-fluorophenyl）amino）-6-methoxyquinazolines， which were prepared from 7-（benzyloxy）-6-methoxyquinazolin-4-ol， and piperidines obtained from N-Boc-3/4-piperidones. Their structures were characterized by1H-NMR，13C-NMR， MS and HRMS. In vitro antitumor activity of the title compounds were evaluated by SRB assay.

Results Twenty novel compounds were synthesized in this work. Among them， seven compounds （at 30 μmol/L） were found to have ＞ 65% inhibition against A549 cell line. Compounds 15b1 （IC50： 1.94 μmol/L） and 16b2 （IC50： 0.26 μmol/L） against A549 cells and compound 15b2 （IC50： 4.83 μmol/L） against KB cells were more active than or comparable to vandetanib.

Conclusion The structure skeletons at C-7 position of vandetanib were enriched. Compound 16b2 with much higher activity than vandetanib against A549 cells is worthy of further research.

Author Affiliations： Department of Medicinal Chemistry， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China （ZHANG Rui， XIA Gui-min， Lü Kai， LIU Shan， ZHANG Jun，LIU Ming-liang）； Zhejiang Starry Pharmaceutical Co. Ltd.， Xianju 317300， China （ZHANG Jun）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):432-436

Design， synthesis and in vitro antitumor activity of vandetanib derivatives

ZHANG Rui， XIA Gui-min， Lü Kai， LIU Shan， ZHANG Jun， LIU Ming-liang

Chemistry techniques， synthetic； Antimetabolites， antineoplastic； Vandetanib derivatives

LIU Ming-liang， Email： lmllyx@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.008

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所有機化學室（張芮、夏桂民、呂凱、柳珊、張俊、劉明亮）；317300 仙居，浙江司太立制藥股份有限公司（張俊）

劉明亮，Email：lmllyx@126.com

2016-04-29