豬苓菌核自噬相關基因ATG8的克隆及表達分析

劉蒙蒙，邢詠梅，郭順星

豬苓菌核自噬相關基因ATG8的克隆及表達分析

劉蒙蒙，邢詠梅，郭順星

目的 克隆分離豬苓自噬相關基因 ATG8，并探討其在豬苓防御蜜環菌入侵過程中的作用。

方法 以豬苓菌核為材料，采用 RT-PCR 方法得到自噬相關基因的開放讀碼框全長，并利用熒光定量 PCR 檢測該基因在不同豬苓菌核部位的表達量。

結果 該基因開放讀碼框為 387 bp，編碼 128 個氨基酸；該蛋白分子量為 14.838 kD，理論等電點為 5.85。氨基酸序列多重比對及系統發育樹結果顯示 PuATG8 與蟻巢傘屬（termitomyces sp.）親緣關系最近，與皺革菌（Punctularia strigosozonata）、密褐褶孔菌（Gloeophyllum trabeum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）有較高的同源性。PuATG8 為ATG 家族同源基因。熒光定量 PCR 結果表明，PuATG8 在未被蜜環菌侵染的豬苓菌核及被蜜環菌侵染的菌核中都有表達，其中被侵染部分的表達量顯著上調。

結論 PuATG8 可能參與了豬苓菌核的防御反應。

豬苓； 自噬； 基因表達； 克隆

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2016, 11(5):415-419

細胞自噬是廣泛存在于真核生物細胞內的一種正常的分解代謝過程，是細胞在缺乏營養或脅迫條件下，通過降解細胞內衰老的蛋白質、受損傷的細胞結構和細胞器，為細胞的重建、再生和修復提供必需原料，實現細胞內物質的再利用，是生物體中一種重要的防御和保護機制［1-2］。自噬在生物的許多生理過程中扮演著重要的角色，比如生物體對外界脅迫的適應：如氧化應激脅迫［3］、鹽［4］、干旱［5］和微生物侵染［6-7］等；參與生物體生長發育和分化過程中的細胞重建［8］。所以細胞自噬在真核細胞中是一個無處不在的正常的代謝過程［9］，作為一個細胞質量控制開關來消除衰老的細胞器和結構以維持內穩態［10-11］。但迄今為止，關于自噬過程的研究仍主要集中在酵母和哺乳動物中，在微生物中，尤其是大型真菌中的研究還特別少。

自噬相關（ATG）蛋白參與許多細胞自噬過程的核心階段［12］。目前，已經在酵母中發現了 31 種ATG 蛋白，其中 18 種蛋白（ATG1-10、ATG12-14、ATG16-18、ATG29、ATG31 等）已經被證明參與了自噬體的形成［13］。在自噬體形成的過程中，大部分自噬蛋白都以其獨特的作用方式行使著不同的功能。

豬苓菌核與蜜環菌是一種特殊的共生關系。在自然條件下只有當蜜環菌侵入豬苓菌核時豬苓菌核才能生長發育。在形成共生關系的過程中，蜜環菌會侵入豬苓菌核。豬苓人工栽培實踐已經證明，栽培豬苓菌核不加帶有生長蜜環菌菌索的菌棒，豬苓就不能生長繁殖。在實踐生產中利用蜜環菌菌材伴栽豬苓技術，尤其是在栽培穴中增放大量樹葉后，對提高豬苓產量起到了極好的效果。本課題組先前的形態學研究發現，在蜜環菌侵染豬苓菌核的部位，部分豬苓菌核細胞會激發自噬降解過程，但是其分子機制尚屬空白。

本課題組在前期構建豬苓 RNA-seq 文庫中發現一個特異表達的 unigene 序列，它與自噬相關蛋白基因 ATG8 具有高度同源性，推測該序列在蜜環菌侵染豬苓菌核部位高表達，可能與豬苓的防御性相關。本研究以豬苓為材料，以 unigene 序列為基礎設計基因特異性引物，利用 RT-PCR 方法克隆了unigene 的開放讀碼框的全長，對其全長序列、結構和功能進行初步分析，并對其在蜜環菌侵染豬苓菌核后的表達進行了分析，以期為進一步揭示該基因的功能以及探討豬苓防御反應的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試豬苓菌核 2014 年 8 月采自山西古縣豬苓廠。

1.1.2 主要試劑和儀器 M-MLV Reverse Transcriptase Kit 購于美國 Promega 公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Mix 購于南京諾唯贊生物科技有限公司；RNeasy 植物 RNA 快速提取試劑盒購于 Qiagen 公司；膠回收試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒、Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit 和大腸桿菌（Escherichia coli）JM109 感受態細胞均購于北京艾德萊生物科技有限公司；NanoDropTM2000 分光光度計購于美國 Thermo Fisher 公司。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 提取及檢測 應用 RNeasy 植物RNA 快速提取試劑盒并按照操作說明提取各樣品RNA，使用 NanoDropTM2000 分光光度計測定各總 RNA 質量和純度，使用 1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整性。應用 M-MLV Reverse Transcriptase Kit 反轉錄合成 cDNA 第一鏈并存放于 -20 ℃ 備用。

1.2.2 基因克隆 在本課題組已測得的豬苓轉錄組數據庫中搜索到一個自噬相關基因 ATG8 的全長 cDNA 序列，利用 Primer3 軟件（http：// bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）分別從起始密碼子與終止密碼子開始設計一對引物，即 ATG8p1：ATGG TCAGGTCCAAGTTCAAAGACG，ATG8p2：TCA TGCATCGGATGGTAACTCTAGC。以豬苓 cDNA為模板進行 RT-PCR，總反應體積為 25 μl，包括：10 mmol/L dNTPs 0.5 μl，1 μl cDNA，12.5 μl Phanta Max Buffer，0.5 μl Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，ATG8p1 及 ATG8p2 各 1 μl（10 mmol/L）和 8.5 μl ddH2O。擴增反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環；72 ℃ 延伸 10 min。

1.2.3 ATG8 基因的生物信息學分析 利用 ORF Finder 程序（http：//www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.htmL）進行開放閱讀框架預測，Blast 程序（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/）進行序列同源性的比較，ExPASy 的 ProtParam 工具（http：//www.expasy.org/ tools/protparam.html）進行蛋白質理化性質（等電點、分子量）分析，MEGA 6.0 軟件進行氨基酸序列同源性分析及系統發育分析，構建 Neighbor-Joining進化樹，1000 次重復，其他均為默認設置。

1.2.4 實時熒光定量 PCR 分析 利用實時熒光定量 PCR 技術分析 ATG8 的表達，用豬苓β-tublin 基因作為內參。分別取被蜜環菌侵染的菌核（CT）以及未被蜜環菌侵染的菌核（CK）提取RNA 后用 M-MLV Reverse Transcriptase Kit 反轉錄獲得 cDNA，用 Roche LightCycler?480II 對目的基因的表達水平進行檢測。根據 ATG8 基因全長設計熒光定量引物 Q-ATG F（5' AGACGAGCA TCCCTTTGAGA 3'）和 Q-ATG R（5' TTGGCCA ACAGTGAGATCAG 3'），并以豬苓 β-tublin 為內參基因，引物為 tub-F（5' CCTTCCTTGGCAACTC GACA 3'）和 tub-R（5' TCGTCCATACCCTCC TGTGT 3'）。使用 SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行 qPCR 反應，其體系為 15 μl，其中包括 7.5 μl 2 × SYBR?Premix ExTaqTMMaster Mix，0.5 μl 引物（10 μmol/L），2 μl cDNA 模板以及 4.5 μl ddH2O。反應程序設定如下：預變性 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 32 s，40 個循環，同時繪制熔解曲線。所有 PCR 反應都設 3 次重復。

2 結果

2.1 PuATG8 基因全長的克隆

以未被蜜環菌侵染的豬苓菌核的 RNA 所反轉錄的 cDNA 為模板，利用引物 ATG8p1 和ATG8p2 通過 RT-PCR 方法得到一個長度約為400 bp 的片段（圖 1），得到的產物片段經回收、克隆、測序獲 387 bp 的完整 ORF 序列，與轉錄組文庫中的 unigene 序列的 ORF 區一致，進而驗證已成功獲得 PuATG8 基因的全長 ORF。BLAST分析表明其為 ATG8 的同源基因，因此將其命名為PuATG8。

圖1 基因擴增結果（A：PuATG8；M：DL2000）Figure 1 PCR product of PuATG8 （A： PuATG8； M： DL2000）

2.2 PuATG8 蛋白結構及序列分析

PuATG8 編碼 128 個氨基酸，推導 PuATG8蛋白分子量為 14.838 kD，理論等電點 5.85。將推測的氨基酸序列提交到 NCBI 的保守域數據庫（Conserved Domain Database，CDD）進行搜索，結果顯示該蛋白序列具有 ATG8 蛋白的完整保守結構域和功能位點（圖 2）。

將推測的氨基酸序列在 NCBI 上進行 Blastp比對分析后發現，PuATG8 與皺革菌（Punctularia strigosozonata）、密褐褶孔菌（Gloeophyllum trabeum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和毛韌革菌（Stereum hirsutum）的 ATG8 相似度較高，分別為 98%、97%、97% 和 96%，部分結果見圖 3。

選取 10 個與 PuATG8 蛋白同源性較高的其他真菌的 ATG8 蛋白，分析其系統進化關系，用MEGA 6.0 通過 Neighbor joining（NJ）法構建了系統發育樹。結果顯示，PuATG8 與蟻巢傘屬（termitomyces sp.）遺傳距離最近，其次是Moniliophthora roreri 和毛韌革菌（Stereum hirsutum）（圖 4）。

2.3 PuATG8 在豬苓菌核中的表達

通過實時定量 PCR 檢測豬苓菌核不同部位的PuATG8 基因的轉錄達水平，10 倍梯度稀釋測得PuATG8 基因引物和內參基因 β-tublin 引物擴增效率分別為 95.26% 和 94.43%，兩對引物熔解曲線都只有對應的單峰，沒有出現二聚體雜峰，符合實時熒光定量 PCR 要求。定量 PCR 結果表明該基因在被蜜環菌侵染的豬苓菌核中的表達量要高于未被蜜環菌侵染的豬苓菌核，是其的 7.85 倍（圖 5）。表明 PuATG8 基因可能參與豬苓菌核對蜜環菌脅迫的應答過程。

圖2 ATG8 蛋白的保守結構域Figure 2 Conserved protein domains of ATG8 protein

圖3 PuATG8 氨基酸序列比對分析Figure 3 Alignment and analysis of amino acid sequences of PuATG8

圖4 系統進化樹分析Figure 4 Phylogenetic tree analysis

圖5 豬苓 PuATG8 蛋白基因的組織特異性表達分析（CK：未被侵染的豬苓菌核；CT：被蜜環菌侵染的豬苓菌核）Figure 5 qRT-PCR analysis of the PuATG8 expression （CK：Controlled medullar tissue； CT： Treated medullar tissue）

3 討論

本研究從豬苓中克隆得到了一個自噬相關基因 PuATG8 的全長 ORF。氨基酸序列多重比對及系統發育樹結果顯示 PuATG8 與蟻巢傘屬（termitomyces sp.）親緣關系最近，與皺革菌（Punctularia strigosozonata）、密褐褶孔菌（Gloeophyllum trabeum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）有較高的同源性。且具有保守的組氨酸結構域，這些結果表明，PuATG8 為 ATG8 家族的同源基因，可能與其他 ATG8 具有相似的結構和功能。

ATG8 是自噬體的標記蛋白［14］。ATG8 基因家族編碼類泛素蛋白，它們在自噬體的形成過程中起著重要的作用［15-16］。現有研究證明，擬南芥無論在正常營養條件下還是在營養缺乏條件下，都會表達ATG8 基因，并且其在根中的表達量高于莖和葉中的表達量，基因主要分布在成熟區及接觸土壤吸取營養的根冠部位表達，說明自噬相關基因與植物在逆境環境下的生存有關系［17］。Yoshimoto 等［18］通過熒光定量 PCR 發現擬南芥在缺氮的條件下，ATG8a-ATG8f 基因會上調表達。另外，在其他逆境脅迫下，也觀察到植物中 ATG8 基因的上調表達。如被灰霉病菌侵染擬南芥，通過 RNA gel-blot 分析檢測到 ATG8a 表達上調［19］；將玉米放置黑暗條件，進行缺氮處理，通過 RT-PCR 與 Western blot 檢測，均觀察到了 ATG8 的上調表達［20］。以上實驗，從 RNA 水平和蛋白質水平證明了自噬基因參與了植物的抗逆生理過程。

ATG8 基因在響應生物脅迫中均表現出了一定的功能，自噬體可能具有雙重功能：抗細胞死亡或促細胞死亡，而自噬體發揮何種功能依賴于自身的水平。本試驗中熒光定量結果表明 PuATG8 基因在受到蜜環菌侵染后，豬苓菌核可能通過增加PuATG8 表達量來參與逆境脅迫應答過程。PuATG8基因在豬苓菌核抵抗逆境中的具體作用有待進行深入研究。

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Objective To clone and isolate the autophagy-related protein 8 （ATG8） gene and investigate the function of this gene in the defense of Polyporus umbellatus.

Methods A new ATG8 gene， designated as PuATG8， was isolated from the Polyporus umbellatus sclerotia using RT-PCR. The expression analysis of PuATG8 in different parts of Polyporus umbellatus sclerotia was carried out by quantitative RT-PCR assay.

Results The full-length of open reading frame was 387 bp， encoding a putative protein of 129 amino acids with a molecular weight of 14.838 kD and a theoretical pI of 5.85. Phylogenetic tree analysis indicated that PuATG8 had the highest similarity with ATG8 from termitomyces sp.， and was highly homologous to Punctularia strigosozonata， Gloeophyllum trabeum and Rhizoctonia solani. Quantitative RT-PCR showed that PuATG8 was expressed in P. umbellatus sclerotia irrespective of Armillaria infection. Meanwhile， the expression of PuATG8 in the sclerotia with A. mellea infection was significantly up-regulated.

Conclusion This PuATG8 gene may be involved in the defense response of Polyporus umbellatus sclerotia.

Author Affiliations： Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100193， China （LIU Meng-meng， XING Yong-mei， GUO Shun-xing）； Institute of Bioinformatics and Medical Engineering， School of Electrical and Information Engineering， Jiangsu University of Technology， Changzhou 213001， China （LIU Meng-meng）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):415-419

Cloning and expression analysis of a autophagy-related protein 8 encoding gene in Polyporus umbellatus

LIU Meng-meng， XING Yong-mei， GUO Shun-xing

Polyporus umbellatus； Autophagy； Gene expression； Gene cloning

GUO Shun-xing， Email： sxguo1986@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.005

國家自然科學基金（30830117、31201666）；山西省煤基重點科技攻關項目（FT2014-03）；河北山區特色中藥材種質資源評價與仿野生栽培技術研究與示范（16232503D）

100193 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所（劉蒙蒙、邢詠梅、郭順星）；213001 常州，江蘇理工學院電氣信息工程學院生物信息與醫藥工程研究所（劉蒙蒙）

郭順星，Email： sxguo1986@163.com

2016-07-25