重組膠原蛋白制備及其應用研究進展

唐云平,鄭　強,胡　斌,蔡　謹,黃　磊,徐志南,*

(1.浙江大學化學工程與生物工程學院,浙江杭州 310027;2.浙江麗水學院生態學院,浙江麗水 323000)

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重組膠原蛋白制備及其應用研究進展

唐云平1,鄭強2,胡斌1,蔡謹1,黃磊1,徐志南1,*

(1.浙江大學化學工程與生物工程學院,浙江杭州 310027;2.浙江麗水學院生態學院,浙江麗水 323000)

膠原蛋白由于其獨特的理化性質和生物功能,在食品、化妝品、生物醫學等領域的應用日益廣泛。然而,從動物組織中提取的膠原蛋白存在動物源疾病等風險,限制了其許多潛在用途的開發。重組(類)膠原蛋白具有與天然膠原蛋白相似的性質和功能,近年來,國內外學者對重組(類)人膠原蛋白的表達進行了廣泛的研究。本文綜述了近年來重組(類)人膠原蛋白表達、分離純化和應用方面的研究進展,為該重組蛋白的制備提供指導意義。

膠原蛋白,類膠原蛋白,重組表達,純化,應用

膠原蛋白是動物細胞外基質中的一種主要結構蛋白。它由三股α-螺旋結構的肽鏈纏繞形成的纖維狀蛋白,其一級結構由(Gly-X-Y)n重復序列組成,其中X通常為脯氨酸,Y為羥脯氨酸或羥賴氨酸[1]。近年來,膠原蛋白被廣泛用于食品、化妝品、生物醫學等領域。膠原蛋白主要從動物結締組織中提取獲得,但從動物組織中提取的膠原蛋白存在動物源疾病等風險,限制了其潛在應用和開發[2]。因此,利用基因工程技術生產重組膠原蛋白就顯得非常重要。本文對重組(類)人膠原蛋白的國內外研究進展進行了綜述并介紹了其在食品、化妝品和生物醫學等領域中的應用,為該重組蛋白的制備提供指導意義。

1　膠原蛋白和類人膠原蛋白

膠原蛋白是結締組織中最主要的結構蛋白,它的基本結構是原膠原,每個原膠原分子都由三條α肽鏈組成,而每個α肽鏈都會形成左手螺旋,三條左手螺旋扭在一起形成一個大的右手螺旋結構(圖1)。膠原蛋白的種類多,結構復雜,目前發現的膠原蛋白至少有28種,但其基本結構卻大同小異。

圖1　膠原蛋白的三維螺旋結構Fig.1　Human collagen structures that arevisualized using PDB:IBKV in three different forms注:Tube(A),CPK(B)and ball and stick model(C)。

類人膠原蛋白則是根據人膠原蛋白的特性進行優化或引入特殊功能的氨基酸序列,通過重組表達獲得的具有類似膠原蛋白特性的蛋白。與傳統提取獲得的膠原蛋白相比,主要具有可加工性、無病毒隱患、水溶性好、批次穩定和排異反應低等優點。

2　重組(類)人膠原蛋白的異源表達

目前,許多重組表達系統被應用于(類)人膠原蛋白的重組表達,如大腸桿菌、酵母、動物細胞、轉基因動物和轉基因植物等,重組(類)人膠原蛋白的表達情況見表1。

表1　(類)人膠原蛋白在各表達系統中的表達總結

2.1利用大腸桿菌表達(類)人膠原蛋白

大腸桿菌表達系統是目前應用最廣泛的蛋白質表達系統,其遺傳背景清楚,發酵成本低、生產周期短、效率高,可以快速大規模生產外源蛋白,具備規模化生產外源蛋白的潛力。目前,重組大腸桿菌生產的(類)人膠原蛋白主要分為羥基化和非羥基化兩大類。

2.1.1非羥基化的類人膠原蛋白大腸桿菌表達系統由于自身缺乏脯氨酸羥化酶,因此在單獨表達膠原蛋白時不能獲得羥基化的膠原蛋白。Yin等[3]在大腸桿菌中表達類人膠原蛋白[(GAPGAPGSQGAPGLQ)52],通過條件優化可獲得0.1～0.2 g/L的重組類人膠原蛋白。Yao等[4]在大腸桿菌中表達類人膠原蛋白([GERGDLGPQGIAGQRGVV(GER)3GAS]8),產量為50～70 mg/L。

2.1.2通過添加羥脯氨酸獲得羥基化人膠原蛋白大腸桿菌自身缺乏脯氨酸羥化酶,但培養過程中,在含有高濃度NaCl的培養基中添加羥脯氨酸,可獲得羥基化的重組膠原蛋白[5]。但該法合成的膠原蛋白與來自于組織中的天然膠原有一定程度的差異,羥脯氨酸在Gly-X-Y三聯體中的X和Y位置均可能出現,X位的脯氨酸發生羥化后會使得膠原蛋白的熱穩定性減弱。

2.1.3通過與羥化酶共表達獲得羥基化(類)人膠原蛋白將(類)人膠原蛋白和脯氨酸羥化酶基因一起在大腸桿菌中共表達可獲得羥化的類人膠原蛋白。目前使用的脯氨酸羥化酶基因主要有病毒來源的羥化酶和人源脯氨酸羥化酶。例如,Rutschmann等[6]在大腸桿菌中將人源III型膠原蛋白和病毒來源的脯氨酸羥化酶一起共表達,獲得羥化的重組膠原蛋白,產量為90 mg/L。但該羥化酶既能催化Gly-X-Y三聯體中X位的脯氨酸,也能催化Y位上的脯氨酸。因此,有必要對該羥化酶進行分子改造,提高該酶對底物的專一性,使重組膠原蛋白的熱穩定進一步增強。本課題組[1]通過將類人膠原蛋白、人源脯氨酸羥化酶和D-阿拉伯糖-1,4-內酯酶基因一起在大腸桿菌中共表達,獲得了羥化的類人膠原蛋白,產量為0.26 g/L。雖然在大腸桿菌中可獲得羥化的類人膠原蛋白,但產量普遍不高,為滿足市場上對膠原蛋白的需求還須不斷的探索與改進。

2.2利用酵母表達(類)人膠原蛋白

迄今為止,利用酵母表達(類)人膠原蛋白的研究較多,如畢赤酵母、漢遜酵母和釀酒酵母等[7-8,12-13]。其中利用畢赤酵母表達獲得的重組(類)人膠原蛋白的表達量和羥化效率最高。例如,Myllyharju等[7]將人源膠原蛋白I、II和III基因整合到含脯氨酸羥化酶的畢赤酵母工程菌中,獲得的重組膠原蛋白均能被充分羥基化且產量為0.2～0.6 g/L。通過進一步優化發酵工藝條件,重組人源I、II和III型膠原蛋白在畢赤酵母中的產量分別可達1.1、0.7、1.5 g/L[8]。總得來說,(類)人膠原蛋白能夠在畢赤酵母中進行充分的羥基化表達,且隨著發酵產量的逐步提高,具備工業化生產的前景。

2.3利用動植物表達(類)人膠原蛋白

國外對膠原蛋白在轉基因動植物中的重組表達也進行了大量的研究,如轉基因鼠、蠶、玉米和番茄等。例如,Toman等[9]利用鼠的乳腺細胞中表達重組I型人膠原蛋白,產量為8 g/L,但該表達系統的培養基昂貴,操作繁瑣并不適合商業化生產。Adachi等[10]在蠶的中部絲腺中表達人I型膠原蛋白αI,重組蛋白在蠶繭中的含量達8%。Stein等[11]在番茄中將I型人膠原蛋白、人源脯氨酸羥化酶和賴氨酸羥化酶基因進行共表達,產量為20 g/L且羥脯氨酸和羥賴氨酸的含量分別為7.55%和0.74%,和天然I型人膠原蛋白非常接近,該技術已被Collplant公司用來商業化生產重組I型人膠原蛋白。

3　重組(類)膠原蛋白的分離純化

重組蛋白的分離純化是發酵產品規模化生產的限制因素,純化費用約占生產成本的20%～30%,甚至更高。目前,重組(類)膠原蛋白的分離純化方法主要有:親和層析法、鹽析沉淀法、離子交換層析法和凝膠過濾層析結合法等。Tang等[1]利用親和層析對重組類人膠原蛋白進行了分離純化,回收率為68.6%。王曉軍等[14]利用硫酸銨沉淀、DEAE-52陰離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析對破碎液中重組類人膠原蛋白進行大規模的分離純化,最終產物純度達98%,回收率為80.5%,達到了工業化生產的要求。

4　重組膠原蛋白的應用

4.1在食品領域中的應用

膠原蛋白在食品領域中的應用,主要包括以下幾方面:作為功能性食品和保健品，經常食用膠原蛋白豐富的食品可增加皮膚組織細胞的儲水能力,增強和維持肌膚良好的彈性,延緩肌體衰老;作為肉制品改良劑,可影響肉類的嫩度,改善產品品質,提高蛋白質含量;作為食品包裝材料,如人工腸衣等。重組(類)膠原蛋白應用于食品領域的報道不多,俞園園將鋅和鈣等微量元素與重組類人膠原蛋白進行螯合,獲得類人膠原蛋白-鋅、類人膠原蛋白-鈣等螯合物,為補鈣或補鋅等制劑的制備奠定基礎[15-16]。

4.2在化妝品領域中的應用

膠原蛋白中含有大量羧基和羥基的氨基酸,如羥脯氨酸、羥賴氨酸以及甘氨酸等天然保濕因子,對皮膚具有很好的保濕效果。此外,膠原蛋白多肽與皮膚細胞的生長、分裂、增殖、遷移以及分化有關,可提供養分從而延緩皮膚衰老并且還具有促進皮膚的創面修復和抗輻射的作用,因而廣泛用于化妝品領域。

4.3在生物醫學領域中的應用

膠原蛋白具有低抗原性、可生物降解性、生物相容性和促進血小板凝聚等生物學特性,是非常重要的天然生物材料。重組人源I型膠原蛋白制備成的海綿具有多孔微觀結構和低炎癥反應的特性,可被運用于細胞組織的再生[8]。重組人源II型膠原蛋白能刺激細胞外軟骨基質的更新合成,被應用于軟骨再生[17]。此外,重組膠原蛋白還被應用于混合仿生學或互穿網絡支架,如制備人工角膜等[18]。

5　前景與展望

由于其特有的三重螺旋結構和功能特性,膠原蛋白可廣泛用于食品、化妝品、化工和生物醫學等領域。雖然利用重組表達系統生產(類)膠原蛋白的研究取得了一些進展,但是還有很多問題亟需解決。相信隨著技術水平的進步和人們對基因重組蛋白的認可,重組(類)膠原蛋白在食品、化妝品和生物醫學等領域的應用也將得到進一步的提高。

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Research progress on preparation and application of recombinant collagens

TANG Yun-ping1,ZHENG Qiang2,HU Bin1,CAI Jin1,HUANG Lei1,XU Zhi-nan1,*

(1.College of Chemical and Biological Engineering,Zhejiang University,Hangzhou 310027,China;2.College of Ecology,Lishui University,Lishui 323000,China)

Collagens have been widely used in food,cosmetic and biomedicine for its unique physical and chemical properties and biological functions. However,collagens used in these fields were commonly extracted from animal tissues,thus its application was limited by the risk of animal-derived contaminating pathogens and difficulties in the preparation. Recombinant human collagen-like proteins have the some properties and functions as the natural collagens. In recent years,human collagen-like proteins have been expressed in a variety of expression systems. The new research progress of bio-production and purification of recombinant collagen-like proteins and their application have been reviewed in this paper. This work will be helpful to the large-scale preparation of the recombinant human collagen-like proteins in the future.

collagen;collagen-like protein;recombinant expression;purification;application

2016-03-23

唐云平(1985-)，男，博士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：11128056@zju.edu.cn。

徐志南(1966-)，男，博士，教授，研究方向：生物化工，E-mail：znxu@zju.edu.cn。

國家自然科學基金(21306164)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)18-0384-03

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.065