還原型谷胱甘肽對四氧化二氮致小鼠肺損傷的防護作用

胡　杰,方　輝,李德遠,*,喬　燕

(1.軍事經濟學院軍需系,湖北武漢 430035;2.軍事經濟學院醫院,湖北武漢 430035)

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還原型谷胱甘肽對四氧化二氮致小鼠肺損傷的防護作用

胡杰1,方輝1,李德遠1,*,喬燕2

(1.軍事經濟學院軍需系,湖北武漢 430035;2.軍事經濟學院醫院,湖北武漢 430035)

目的:探討還原型谷胱甘肽(GSH)對四氧化二氮(N2O4)吸入致小鼠肺損傷的防護作用。方法:動物模型采取在120 L靜式染毒柜內吸入N2O4的方法制作。雄性ICR小鼠64只,隨機分為對照組,染毒組,GSH低、中、高劑量干預組(GSH低、中、高劑量+染毒),共五組,對照組8只,其余每組14只。染毒前,干預組分別灌胃GSH(1.25、2.50、3.75 g/kg bw·d),對照組和染毒組灌胃等體積生理鹽水,連續7 d,第7 d灌胃1 h后染毒。脫臼處死動物,檢測肺組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量,觀察肺病理改變。結果:與對照組比較,染毒組肺組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量均極顯著降低(p<0.01);與染毒組比較,GSH低、中劑量干預組肺組織SOD和GSH-Px活性均極顯著提高(p<0.01),GSH低劑量干預組MDA含量極顯著提高(p<0.01),GSH中劑量干預組MDA含量顯著提高(p<0.05)。病理切片顯示,GSH干預組比染毒組肺損傷程度輕。結論:GSH對N2O4吸入致小鼠肺損傷具有顯著防護作用,其作用機制可能與其抑制氧化損傷有關。

還原型谷胱甘肽,四氧化二氮,肺損傷,防護作用

四氧化二氮(N2O4)是我國大型運載火箭液體推進劑的主要組分,具有強氧化性、腐蝕性和易揮發等特點,通過呼吸道吸入中毒可導致肺損傷,在各類火箭發射任務中,以N2O4為主的氮氧化物吸入中毒事故偶有發生[1-2]。目前,N2O4吸入致肺損傷的研究主要見于臨床救治[3-4],而關于飲食防護的研究報道較少[5]。

表1　小鼠肺組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量

注:**:與對照組比較差異極顯著,p<0.01;Δ:與染毒組比較差異顯著,p<0.05;ΔΔ:與染毒組比較差異極顯著,p<0.01。

谷胱甘肽是一種天然活性物質,存在于多種生物細胞中,以小麥胚芽、酵母和動物肝臟中含量較高[6]。谷胱甘肽以兩種形式在體內存在,氧化型(GSSG)和還原型(GSH),還原型谷胱甘肽(GSH)約占95%,是谷胱甘肽的活性成分。GSH參與體內氧化還原過程,它具有抗氧化、解毒和細胞保護等多種生理功能,在醫療、保健品和食品等行業應用廣泛[7]。GSH可作為一種生物活性添加劑,應用于抗腫瘤、增強免疫力和延緩衰老等保健食品中;還可作為營養強化劑,應用于乳幼兒和孕婦等的口服保健品中[8]。相關研究表明,GSH對急性肺損傷(ALI)具有重要保護作用。Buchler[9]證實,GSH對次氯酸鹽誘導的家兔ALI有明顯緩解作用。殷娜等[10]觀察到,GSH能有效對抗鹽酸吸入致大鼠ALI。但是關于GSH對N2O4中毒所致動物肺損傷的保護作用,還未見報道。研究表明,ALI和肺組織氧化應激關系密切[11-12]。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)以及丙二醛(MDA),是反映體內過氧化損傷程度的常用指標。因此,本研究結合小鼠肺組織SOD和GSH-Px活性以及MDA含量的變化,探討GSH對N2O4吸入致小鼠肺損傷的防護作用,為開發富含GSH的食品和保健品提供借鑒和參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雄性ICR小鼠、飼料體質量為21～24 g,清潔級,購自北京大學醫學院實驗動物中心,許可證號:SYXK(京)2006-0025;液態N2O4純度>99.5%,由航天科技集團公司第101所提供;GSH食品級,西安瑞林生物科技有限公司;GSH-Px、SOD以及MDA檢測試劑盒南京建成生物工程公司。

120 L靜式染毒柜由軍事醫學科學院提供;防護面罩天津恩澤科技有限公司;NO2濃度檢測管由總裝備部軍事醫學研究所提供;UV-245型分光光度計日本島津公司;3-16PK型高速冷凍離心機Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物建模借鑒劉松等的方法[13],采取在120 L靜式染毒柜內吸入N2O4的方式。柜內設有溫度計和微型風扇,溫度始終保持(25±1) ℃。用微量注射器抽取液態N2O450 μL,由側面專用小孔注入柜內,開動風扇使N2O4充分揮發并均勻擴散,每隔10 min向柜內補充2 μL N2O4,維持N2O4濃度。除對照組外,所有小鼠均在染毒柜內吸入染毒,時間0.5 h。染毒后將小鼠取出,正常飼養。

1.2.2實驗分組ICR小鼠64只,適應性飼養7 d,飼養環境恒溫(23±1) ℃,恒濕52%±3%,自由飲水和攝食。適應期后隨機分為對照組,染毒組,GSH低劑量+染毒組,GSH中劑量+染毒組,GSH高劑量+染毒組,共五組,對照組8只,其余每組14只。染毒前,GSH三個劑量干預組分別灌胃給予1.25、2.50、3.75 g/kg bw的GSH[10,14],每只0.3 mL,每天1次,連續7 d,對照組和染毒組灌胃等體積生理鹽水,第7 d灌胃后1 h,按照動物損傷模型染毒。染毒12 h后,每組取8只,脫臼處死,取肺組織,觀察病理改變,并檢測各項生化指標;染毒84 h后,觀察染毒組和GSH干預組其余6只小鼠的肺病理改變。

1.2.3指標測定小鼠處死后,迅速取左肺組織,用冰生理鹽水沖洗、稱重,冰浴中勻漿,制備10%肺勻漿液。4 ℃條件下以3000 r/min離心10 min,取上清液。分別采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性、二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH-Px活性、硫代巴比妥酸法測定MDA含量[15-16]。

1.2.4病理觀察處死動物,立即摘除右肺組織,置4%多聚甲醛溶液中固定,進行常規切片和HE染色處理,光鏡觀察病理學變化。

1.3統計學分析

2　結果與分析

2.1小鼠肺組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量測定結果

如表1所示,染毒組小鼠肺組織SOD活性極顯著低于對照組(p<0.01);與染毒組相比,GSH低、中劑量干預組SOD活性均極顯著升高(p<0.01),GSH高劑量干預組SOD活性改變不明顯。染毒組小鼠肺組織GSH-Px活性較對照組極顯著下降(p<0.01),GSH三個劑量干預組GSH-Px活性較染毒組均極顯著提高(p<0.01)。染毒組小鼠肺組織MDA含量極顯著低于對照組(p<0.01),GSH低劑量干預組MDA含量極顯著高于染毒組(p<0.01),GSH中、高劑量干預組MDA含量均顯著高于染毒組(p<0.05)。

N2O4是中等毒性物質,其沸點較低,常溫下可揮發分解為NO2。研究發現,氮氧化物吸入中毒損傷的靶器官是肺臟,嚴重時可導致ALI,表現為肺水腫,損傷程度取決于吸入劑量[1]。相關研究證實,肺組織氧化應激與ALI密切相關[11-12]。NO2本身為自由基,且具有高度活性,推測其導致ALI的作用機制與其直接參與對肺臟的氧化和過氧化損傷有關[13,17]。

本實驗中,與染毒組相比,中、低劑量GSH干預組小鼠肺組織SOD、GSH-Px活性均顯著提高,表明GSH對N2O4吸入所致小鼠ALI具有保護作用。GSH是生物體內重要的一種內源性抗氧化物,是肺泡上皮襯液中最重要的小分子類抗氧化物質[10],在多種原因引起的氧化應激所致肺損傷中,GSH起重要保護作用[21]。張宏等[22]發現,GSH可減輕內毒素致大鼠ALI癥狀,且越早應用GSH對肺臟保護作用越強。劉振威等[23]報道,GSH可顯著提高ALI大鼠肺組織SOD活性,緩解肺損傷。袁鼎山等[24]證實,GSH可顯著提升ALI大鼠肺組織GSH濃度,減輕氧化應激損傷。因此,GSH對N2O4致小鼠ALI保護作用的機制與其可有效抑制氧化損傷有關。但是,本實驗中,與染毒組相比,GSH高劑量干預組小鼠肺組織SOD活性沒有明顯升高,其詳細作用機制有待進一步研究。

2.2小鼠肺組織病理觀察

組織病理觀察結果表明,對照組小鼠肺組織正常(圖1A);染毒組肺組織出現明顯病變,可見部分出血灶,肺泡和肺間質水腫,大量炎性細胞浸潤等典型ALI癥狀。染毒12 h后,染毒組肺組織腫脹、體積變大、部分淤血(圖1B);84 h后,染毒組肺損傷更嚴重,顯著出血,發白腫脹,有部分肺實變區出現(圖1C)。與染毒組相比,GSH干預組肺組織病變均減輕,灶性出血、肺組織水腫、炎性細胞浸潤等癥狀均得到緩解,而且隨時間延長,肺損傷緩解效果更明顯(圖1D、E)。低劑量GSH(1.25 g/kg bw·d)對N2O4吸入致小鼠肺損傷的防護效果顯著。

圖1　小鼠肺組織病理圖(HE,200×)Fig.1　The pathology picture of mice lung tissue(HE,200×)注:A：對照組、B：N2O4染毒組12 h后、C：N2O4染毒組84 h后、D：GSH低劑量干預組12 h后、E：GSH低劑量干預組84 h后。

3　結論

綜上所述,GSH對N2O4吸入中毒所致小鼠ALI具有明顯防護作用,其作用機制可能與清除自由基和活性氧,提高抗氧化酶活性,恢復機體氧化還原平衡,增強機體抗氧化損傷能力有關。本研究可為以GSH作為基料,為開發防護N2O4損傷的特殊功能性食品提供理論依據,為深加工富含GSH的食品提供參考,也可為N2O4中毒防護研究提供思路。

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Protective effects of reduced glutathione on lung injury induced by N2O4in mice

HU Jie1,FANG Hui1,LI De-yuan1,*,QIAO Yan2

(1.Department of Quartermaster,Military Economic College,Wuhan 430035,China;2.Hospital of Military Economic College,Wuhan 430035,China)

Objective:To study the protective effects of reduced glutathione(GSH)on the lung injury induced by N2O4inhalation in mice. Methods:The mice lung injury model was established through exposing 64 mice to N2O4in a 120 L sealed cabinet. Sixty-four ICR male mice were randomly divided into five groups:the control group,the N2O4group,the low,medium and high dose GSH-treated groups,8 mice in control group,14 mice in the other groups. 1.25,2.50 and 3.75 g/kg bw·d GSH were ig administered to mice in GSH-treated groups respectively for 7 days before poisoning,equal volume of normal saline for control group and N2O4group. The GSH-treated groups and the N2O4group were exposed to N2O4in the cabinet 1 hour after ig administration on 7th day. The mice were killed by dislocation,and the activities of SOD and GSH-Px and the content of MDA in lung tissue were measured,and the pathology change of lung tissue was examined. Results:Compared with the control group,the SOD,GSH-Px activities and MDA content in lung tissue of N2O4group were significantly decreased(p<0.01). Compared with the N2O4group,the SOD and GSH-Px activities in lung tissue of low and medium dose GSH-treated groups were significantly increased(p<0.01),the MDA content in lung tissue of low dose GSH-treated groups was significantly increased(p<0.01),the MDA content in lung tissue of medium dose GSH-treated groups was increased(p<0.05).The pathology change of lung tissue showed that the injury in low dose GSH group was lighter than that in N2O4group. Conclusion:GSH has remarkably protective effects against the lung injury induced by N2O4inhalation in mice,and the mechanism may be related to its inhibitory effect against oxidative damage.

reduced glutathione(GSH);dinitrogen tetroxide(N2O4);lung injury;protective effects

2016-02-21

胡杰(1981-),男，博士，講師，研究方向：軍用食品，E-mail：cangqionghj1981@163.com。

李德遠(1966-)，男，博士，教授，研究方向：軍用食品，E-mail：flycangqiong@sina.com。

TS201.4

A

1002-0306(2016)18-0359-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.060