咸魚中生物胺降解菌的篩選與降解特性研究

吳燕燕,錢茜茜,2,陳玉峰,2,楊賢慶,鄧建朝

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

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咸魚中生物胺降解菌的篩選與降解特性研究

吳燕燕1,錢茜茜1,2,陳玉峰1,2,楊賢慶1,鄧建朝1

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

為獲得用于咸魚等腌制水產品的生物胺降解菌,本文采用生物胺初篩培養基與高效液相色譜技術分析,研究從傳統方法加工的咸魚中分離篩選具有降解生物胺的菌株,通過VITEK 2鑒定系統進行菌種鑒定,并分析菌株的生長曲線、降解生物胺動力學、溫度、pH、鹽度、生物胺底物濃度等特性,及在咸魚中接種菌株對產品生物胺的影響。結果表明:從咸魚中分離篩選到三株具有降解生物胺的菌株,分別是鼠李糖乳酸菌(Lactobacillusrhamnosus,Lr)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,Lp)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus,Pp);對生物胺降解的最適溫度為30～35 ℃,最適pH為5.5～6.0,對食鹽有較好的耐受性,在食鹽濃度≤80 g/L時對生物胺的降解作用尤為明顯,Lr與Lp之間無拮抗作用;接種了生物胺降解菌的咸魚產品中腐胺、尸胺、組胺、酪胺等生物胺含量均顯著性降低(p<0.05),而接種Lr∶Lp=1∶2的混合菌種的咸魚產品生物胺含量下降幅度最大。

咸魚,生物胺降解菌,分離,降解特性

腌制咸魚是一種風味獨特的傳統水產品,深受廣大消費者的喜愛。其傳統生產工藝屬自然發酵,發酵過程微生物種類復雜,產品的品質和安全性難以得到保證[1]。生物胺普遍存在于蛋白質含量豐富的發酵食品中,如發酵香腸、干酪、咸魚、魚露等[2]。當其在人體內積累到較高數量時就會出現一些諸如頭痛、惡心、痙攣等一系列中毒性狀,嚴重的甚至會危及生命[3]。生物胺含量是微生物分泌的氨基酸脫羧酶和生物胺氧化酶共同作用的結果,即脫羧酶催化氨基酸脫羧基,產生并積累生物胺,生物胺氧化酶則氧化并降解生物胺[4]。

長期以來,研究人員一直在嘗試開發能有效控制生物胺的方法,大部分都是通過抑制食品中生物胺產生菌的數量或氨基酸脫羧酶的活性來減少生物胺的產生,如輻照[5]、低溫貯藏[6]、真空包裝[7]等,這些方法在一定程度上可以減少生物胺的產生,但不能消除已產生的生物胺。近年來,具有胺氧化酶的微生物成為研究熱點,通過接種無氨基酸脫羧酶或含生物胺氧化酶的微生物制劑,使其在發酵過程中成為優勢菌,從而降解生物胺或抑制生物胺的生成[8-9]。目前國內外對乳酸菌降解生物胺開展了相關研究。馬宇霞等[10]從熏馬腸中分離鑒定了6株生物胺氧化酶菌株,其中包括鼠李糖乳酸菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌三株乳酸菌;Tosukhowong等[11]研究了植物乳桿菌BCC 9546作為一種降解菌對發酵香腸中生物胺的降解作用;Nie等[12]報道了銀魚香腸接種植物乳桿菌后會對其生物胺產生影響。

目前有關乳酸菌的降解特性還未見文獻報道,因此,本實驗室從傳統腌干魚制品中分離篩選具有生物胺降解活性的微生物,為腌干魚加工過程中發酵劑的選擇提供菌種來源,提高其可食用安全性,并探討溫度、pH、食鹽濃度和生物胺底物濃度對生物胺降解的影響,為生物胺的控制研究提供理論依據,并為腌干魚的工藝革新提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

咸魚傳統法腌制[13],實驗室自制;生物胺標準品:腐胺(PUT)(≥98%)、尸胺(CAD)(≥95%)、組胺(HIS)(≥99%)、酪胺(TYR)(≥99%)均購自美國Sigma公司;乙腈(色譜純)、丹磺酰氯(Dns-Cl,≥99%)、甲醇(色譜純)均購自上海安譜科學儀器有限公司;丙酮(色譜純)購自美國Burdick&Jackson公司;MRS培養基、MRS肉湯培養基均購自廣東環凱微生物科技有限公司;其它化學試劑均為分析純,購于廣州粵升試劑公司;實驗用水均為超純水。

Agilent 1100 高效液相色譜儀美國Agilent公司;立式蒸汽壓力滅菌鍋388型上海申安醫療器械廠;3K30冷凍離心機美國Sigma公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺江蘇蘇凈安泰公司;SPX-320生化培養箱寧波東南儀器廠;TU-1990 紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;T25高速均質機德國IKA公司;熱泵除濕干燥箱上海一恒科技有限公司;VITEK 2 Compact菌種鑒定系統法國生物梅里埃公司。

1.2實驗方法

1.2.1降解生物胺菌的篩選及鑒定在無菌條件下取咸魚背部肌肉10 g,剪碎后放入裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中,混合均勻,用無菌生理鹽水依次稀釋為102、103、104倍,取1 mL上述不同濃度的稀釋液涂布于MRS培養基中,然后置于30 ℃的恒溫培養箱中培養48 h,挑單菌落以平板劃線的方法多次純化。將純化后的單菌落分別接入到改良型MRS肉湯培養基中,以不接種菌的培養基作對照,30 ℃培養48 h后取樣,測定培養基中的生物胺含量。將具有生物胺降解活性的乳酸菌接種于3 mL無菌鹽水(4.5 g/L NaCl,pH4.5～7.0)中,混勻,用比濁儀配制相當于0.80～0.10麥氏單位的菌懸液,使用VITEK 2全自動微生物分析系統進行菌種鑒定[14]。

1.2.2生物胺降解菌的生長曲線測定將乳酸菌活化后,以2%的接種量接入MRS肉湯培養基中,于30 ℃條件下培養,在48 h內每隔6 h取一定量的菌液,稀釋到適宜倍數,測定OD600值。

1.2.3菌株對混合生物胺的降解動力學研究將菌活化后,以2%的接種量分別接種于50 mL,pH為5.5的含四種生物胺(腐胺、尸胺、組胺和酪胺,濃度分別為100 mg/L)的MRS肉湯培養基中,分別置于30 ℃條件下恒溫培養48 h,以未接種的培養基作空白對照,在48 h內每隔6 h取樣檢測實驗組和對照組培養基中生物胺含量,根據公式1計算各生物胺的降解率,繪制菌株對混合生物胺的降解動力學曲線。

式(1)

式中:W0-對照組中生物胺的含量,mg/L;W1-實驗組中生物胺的含量,mg/L。

1.2.4不同培養條件對菌株降解生物胺的影響

1.2.4.1溫度對菌株降解生物胺的影響將菌活化后,以2%的接種量接入(pH5.5、食鹽濃度和生物胺底物濃度均為0、含四種生物胺)MRS肉湯培養基中,分別置于溫度(20、25、30、35、40、45 ℃)條件下培養24h。

1.2.4.2初始pH對菌株降解生物胺的影響將菌活化后,以2%的接種量接入(初始pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、食鹽濃度和生物胺底物濃度均為0、含四種生物胺)MRS肉湯培養基中,置于30 ℃條件下培養24h。

1.2.4.3食鹽濃度對菌株降解生物胺的影響將菌活化后,以2%的接種量接入(食鹽濃度(0、40、80、120、160g/L)、pH5.5、生物胺底物濃度為0含四種生物胺)MRS肉湯培養基中,置于30 ℃條件下培養24h。

1.2.4.4生物胺底物濃度對菌株降解生物胺的影響將菌活化后,以2%的接種量接入(生物胺底物濃度(25、50、100、200、300mg/L)、pH5.5、食鹽濃度為0、含四種生物胺)MRS肉湯培養基中,置于30 ℃條件下培養24h。

分別取樣,檢測培養基中生物胺含量,以未接種的培養基作空白對照。

表1　生物胺降解菌鑒定結果

1.2.5菌株間的拮抗性實驗用接種環挑取活化后的乳酸菌,在一定條件下培養至同一稀釋(108CFU/mL)的不同菌懸液,在MRS平板上作相互垂直劃線接種,于30 ℃恒溫培養箱中培養48 h后,觀察。如兩垂直線交界處無菌生長,則說明這兩菌株之間有拮抗性,即為陽性,否則為陰性。

1.2.6降解生物胺菌在咸魚加工中的應用及效果測定在傳統法咸魚的加工工藝[13]基礎上,加入具有生物胺降解能力的乳酸菌,制作5種不同類型的咸魚:CK組為空白組;A組添加鼠李糖乳酸菌(Lr);B組添加植物乳桿菌(Lp);C組添加鼠李糖乳酸菌和植物乳桿菌混合菌液(Lr∶Lp=1∶2);D組添加鼠李糖乳酸菌和植物乳桿菌混合菌液(Lr∶Lp=2∶1)。發酵劑接種量為108CFU/mL。分別檢測制作的5種咸魚的8種生物胺含量。

1.2.7生物胺含量測定參照參考文獻[15-16]中的Dns-Cl-柱前衍生HPLC-FLD法測定生物胺含量。

1.2.8數據處理采用Excel進行數據統計及作圖,所有樣品均作三次平行;另外顯著性分析采用JMP軟件中的Tukey法進行兩兩比較,以p<0.05 說明變化顯著。

2　結果與分析

2.1降解生物胺菌株的篩選

通過對傳統加工咸魚中菌株的分離純化,獲得58株乳酸菌疑似菌株,對其進行單一菌種發酵后,Dns-Cl-柱前衍生HPLC-FLD法測定生物胺降解量。結果分離到3株具有生物胺降解能力的菌株,分別編號為MRS1、MRS2、MRS3。菌株鑒定結果見表1。其中MRS1經鑒定是鼠李糖乳桿菌(Lr),對腐胺的降解率為30.88%、對組胺的降解率為38.56%、對酪胺的降解率為32.63%;而MRS2為植物乳桿菌(Lp),其對腐胺的降解率為31.29%、對組胺的降解率為26.93%、對尸胺的降解率為35.56%;MRS3為戊糖片球菌(Pp),其對腐胺的降解率最大,達到35.23%、對酪胺的降解率為26.19%,對組胺為20.56%;說明乳酸菌中確實存在能降解生物胺的菌株,這與Almudena García-Ruiz[17]的研究結果相一致,但分離到的菌株其降解腐胺、組胺和酪胺的能力均比Almudena García-Ruiz[17]的從酒中分離到的乳酸菌株高。

2.2菌株生長曲線測定

由圖1可知,在前18 h,Lp的生長速度略高于Lr和Pp,并且Lr和Pp的生長曲線保持高度一致,在18 h后才出現差異。18 h后Lr的生長速度要明顯高于Lp和Pp,其生長曲線隨著時間的增加與其他2個菌株的差異逐漸增大。生長曲線的測定有利于觀察菌株在生長過程中菌體密度的變化,進而掌握菌體的活力變化,以確定菌體的最佳收獲時間。菌體活力強,單位體積菌數多的培養時間為收獲的最佳時間,也就是對數生長末期穩定生長前期。由圖1可以看出,3個菌株的菌體密度隨著培養時間的延長逐漸增大,在培養6 h左右,到達對數生長期,培養24 h后對數生長期結束達到穩定生長期,可見,此時是菌體收獲的最佳時期。當菌株培養到30 h后,開始出現下降趨勢,這是由于培養基中營養物質消耗殆盡或者菌株自身產生某些代謝毒素[18]。

圖1　菌株的生長曲線Fig.1　Growth curve of three kinds of bacteria

2.3菌株對混合生物胺的降解動力學分析

從圖2可以看出,分離到的三種菌均能夠同時降解腐胺、尸胺、組胺和酪胺,在24 h內,菌對肉湯培養基中生物胺的降解率逐漸升高,并在24 h達到最大降解量,此后基本持平或略有下降。其中,菌株Lr對組胺和尸胺有較強的降解能力,最高分別可達37.87%和37.11%;菌株Lp對腐胺和尸胺有較強的降解能力,最高分別可達32.39%和36.39%;菌株Pp也表現出較強的腐胺和尸胺降解能力,最高分達36.92%和27.89%。由此可知,Lr、Lp和Pp在發酵食品中具有一定的應用潛力。由圖1和圖2可得出結論:24 h為菌體最佳收獲時期同時也是菌體降解生物胺的最佳時期,如果發酵時間延長,菌體或多或少會產生一些有毒的代謝產物,這將影響魚肉的品質安全性,所以合適的菌株發酵時間非常重要。

圖2　三種菌對混合生物胺的降解動力學Fig.2　Degradation kinetics of mixed biogenic amines by three kinds of bacteria

2.4不同培養條件對生物胺降解菌的影響

2.4.1不同溫度對生物胺降解菌的影響由圖3可以看出,在不同的溫度處理下,三株菌對生物胺都有不同程度降解,在30 ℃和35 ℃條件下對生物胺的降解率顯著高于20、25、40、45 ℃時的降解率,這可能是由于3種菌都屬于乳酸菌類,其最適生長溫度為30～35 ℃[19]。Lr降解腐胺、尸胺、組胺的最適溫度為30 ℃,最大降解率分別為40.68%、35.66%和42.36%,而對酪胺的最適降解溫度為35 ℃,最大降解率為34.28%。Lp降解腐胺、尸胺、組胺和酪胺的最適溫度均為30 ℃,最大降解率分別為43.69%、35.39%、36.28%和29.98%。Pp降解腐胺、尸胺、組胺和酪胺的最適溫度也為30 ℃,最大降解率分別為38.09%、26.35%、21.01%和28.93%。故三株乳酸菌更適合在30～35 ℃的范圍內降解生物胺。

圖3　溫度對生物胺降解菌的影響Fig.3　The effect of temperature on biogenic amines degrading bacteria

2.4.2不同初始pH對生物胺降解菌的影響從圖4可以看出,三種菌對生物胺的降解能力受培養基pH的影響很大,降解的最適pH是5.5,活性范圍為5.0～6.5。如果pH不在這個范圍內,降解能力均受到不同程度的抑制。Lr在pH=5.5時對腐胺、尸胺、組胺和酪胺的最大降解率分別為29.38%、38.96%、38.94%和31.63%;Lp降解腐胺、尸胺和酪胺的最適pH為5.5,其最大降解率分別達到39.74%、41.23%和26.89%,但是Lp降解組胺的最適pH是6.0,最大降解率為29.47%,這可能是由于分離到的Lp對組胺的降解以酶降解為主,酸降解發揮著次要作用。前期報道提出Natrinema gar HDS3-1也適宜在偏中性的環境中降解組胺[20]。Pp在pH=5.5時對腐胺、尸胺、組胺和酪胺的最大降解率分別為28.92%、27.92%、20.73%和26.18%。

圖4　初始pH對生物胺降解菌的影響Fig.4　The effect of pH in initial period on biogenic amines degrading bacteria

圖5　食鹽濃度對生物胺降解菌的影響Fig.5　The effect of salt on biogenic amines degrading bacteria

2.4.3不同食鹽濃度對生物胺降解菌的影響由圖5可知,三株乳酸菌在食鹽濃度為80 g/L的培養基中仍然保持著一定的生物胺降解能力,說明從傳統加工咸魚中分離出的三株菌具備一定的耐鹽性,可應用于發酵食品加工中。當食鹽濃度為0～40 g/L時,Lr、Lp和Pp對四種生物胺均表現出較高的降解率,而當食鹽濃度達到一定程度(80 g/L以上),對該菌降解生物胺有明顯的抑制作用。當食鹽濃度達到160 g/L時,三種菌基本喪失了對四種生物胺的降解能力。這是由于高食鹽濃度抑制了菌的生長從而影響菌對生物胺的降解,也可能影響了乳酸菌生物胺氧化酶的生成量或抑制了生物胺氧化酶的活性,而使降解能力下降。歐昌榮等[21]分析組胺降解酶的基本酶學性質,也得出不同溫度、pH和食鹽濃度會對酶活性造成很大影響。以上結果表明三種菌在食鹽濃度低于40 g/L的體系中生物胺降解性能最佳,在食鹽濃度40～80 g/L的體系中能發揮一定程度的生物胺降解性能,不適用于食鹽濃度大于80 g/L的環境中。

圖6　生物胺底物濃度對生物胺降解菌的影響Fig.6　The effect of biogenic amines concentrations on biogenic amines degrading bacteria

2.4.4不同生物胺底物濃度對生物胺降解菌的影響由圖6可知,三株菌隨著生物胺底物濃度的增大,其對生物胺的降解率也明顯增加,其中,Lr在底物濃度100 mg/L時對腐胺、尸胺和組胺有最大降解率,分別為39.38%、37.11%和37.87%,在底物濃度200 mg/L時對酪胺有最大降解率,為33.82%;Lp在底物濃度200 mg/L時對腐胺、尸胺和組胺有最大降解率,分別為38.73%、38.66%和29.73%,對酪胺的最大降解率出現在底物濃度100 mg/L時,最大降解率為28.83%;Pp在底物濃度100 mg/L時對腐胺、尸胺和組胺和酪胺均有最大降解率,分別為38.92%、27.95%、22.83%和29.18%。但是當底物濃度高于峰值時,三株菌對生物胺的降解率明顯下降,可能由于菌株受生物胺的毒害作用,影響了菌株的生長,從而降低了降解能力。

2.5菌株間拮抗性實驗

從表2可以看出,Lr和Pp、Lp和Pp之間存在拮抗作用,而Lr與Lp之間無拮抗作用,故本實驗選擇Lr和Lp的組合進行咸魚生物胺降解初步應用。

表2　菌株間拮抗實驗結果

注:Y表示有拮抗作用,N表示沒有拮抗作用。

2.6生物胺降解菌對咸魚中生物胺的降解效果

生物胺降解菌對咸魚中生物胺降解效果如表3所示。

表3　生物胺降解菌對咸魚中生物胺的降解效果

注:同一列相同字母表示差異不顯著(p>0.05)。

C組和D組為混合菌組,從表3實驗結果看,C組加工的咸魚產品中腐胺、尸胺、組胺和酪胺含量降幅最明顯,分別下降了7.27、6.2、15.78、2.23 mg/kg,降解率均達30%以上。因此,Lr∶Lp=1∶2的混合菌種具有應用于降解發酵食品中生物胺的潛力,為提高其對生物胺降解率,其混合比例和菌液濃度還需后續具體的工藝優化研究。

3　結論

3.1從傳統方法加工的咸魚中篩選出3株具有生物胺降解能力的菌株,經鑒定分別為鼠李糖乳酸菌(Lr)、植物乳桿菌(Lp)、戊糖片球菌(Pp),在作用24 h對生物胺的降解率均在20%以上。

3.2三株菌對生物胺降解的最適溫度為30～35 ℃,最適pH為5.5～6.0,對食鹽有較好的耐受性,在食鹽濃度≤80 g/L時對生物胺的降解作用尤為明顯;菌株Lr和Pp、Lp和Pp之間存在拮抗作用,而Lr與Lp之間無拮抗作用,所以Lp和Lr可以用作混合菌發酵實驗。

3.3將分離得到的三株菌,在咸魚加工過程接種至魚體中,通過比較表明接種了生物胺降解菌的咸魚產品中生物胺含量均顯著低于對照組,接種Lr∶Lp=1∶2的混合菌種的咸魚產品生物胺含量下降幅度最大,降解率均達到30%以上。該研究為下一步優化生物胺降解菌在咸魚加工過程中的使用條件奠定基礎,也為其在腌制水產品加工中應用提供理論依據。

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Screening and degradation properties of biogenic amines degrading strains in salted fish

WU Yan-yan1,QIAN Xi-xi1,2,CHEN Yu-feng1,2,YANG Xian-qing1,DENG Jian-chao1

(1.Key Lab of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;National Research and Development Center for Aquatic Product Processing;South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510300,China;2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

In order to obtain biogenic amines degrading strains which can be applied to salted aquatic products,strains were isolated from traditional salted fish by microbiological methods and high performance liquid chromatography(HPLC),identified by VITEK 2 strain identification system,and its degradation properties(growing curve,degradation kinetics of mixed biogenic amines,temperature,pH,salt concentration,the effects of adding strains to salted fish on biogenic amine production)were analyzed. The results showed three strains were obtained from traditional salted fish,which were identified asLactobacillusrhamnosus(Lr),Lactobacillusplantarum(Lp),Pediococcuspentosaceus(Pp). The optimal conditions for three strains degrading the biogenic amines were 30～35 ℃,pH5.5～6.0. Three trains had a good tolerate to salt concentration,and a significantly degradation for biogenic amines under 80 g/L salt concentration. There were no antagonism between Lr and Lp. Biogenic amines degrading strains fermentation could notably decrease the content of putrescine,cadaverine,histamine and tyramine(p<0.05),and the salted fish with Lr∶Lp=1∶2 fermentation had the lowest biogenic amines content.

salted fish;biogenic amines degrading strain;isolation;degradation properties

2016-03-11

吳燕燕(1969-),女,研究員,主要從事水產品加工與質量安全方面的研究,E-mail:wuyygd@163.com。

國家自然科學基金項目(31371800);廣東省海洋漁業科技推廣專項(A201301C01,A201501C02)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)18-0173-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.025