大孔樹脂純化葉多酚及其對胰淀粉酶的抑制作用

陳　江,張曉喻,*,劉　剛,王戰國,劉海霞

(1.四川師范大學生命科學學院,四川成都 610100;2.成都大學醫學院(護理學院),四川成都 610100)

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陳江1,張曉喻1,*,劉剛1,王戰國2,劉海霞1

(1.四川師范大學生命科學學院,四川成都 610100;2.成都大學醫學院(護理學院),四川成都 610100)

多酚廣泛存在于各類植物當中,具有多種生理功能[11],但含量相差很大。通常,對多酚進行提取主要采用有機溶劑法[12],但獲得的提取物常含大量雜質,需要進一步純化。大孔吸附樹脂法是根據吸附性和分子篩原理將具有一定極性的有機大分子物質進行分離,該方法吸附選擇性好,處理容量大,能在溫和的條件下進行解析,并且可以充分利用,能有效降低生產成本,適合于工業化生產[13-14]。近年來,越來越多的研究集中在多酚的純化工藝上。馮進等[13]用HPD 400樹脂將藍莓葉中的多酚含量由原來的38.75%提高到69.38%。王旭蘋等[21]用SP850將樹脂純化酒花中的多酚,酒花多酚的純度由13.2%提高到56.6%。張智等[15]研究了落葉松樹皮中多酚的純化工藝,純化后,其含量可高達75.52%。

淀粉酶是影響飲食中淀粉等主要碳水化合物消化、吸收的關鍵酶之一,抑制其活性可以延緩人體對淀粉等物質的降解利用,從而抑制餐后血糖的升高[16-17]。目前已研究證實,植物多酚不僅能夠減少氧化應激作用,而且能夠通過抑制碳水化合物水解酶如淀粉酶、葡萄糖苷酶的作用來預防高血糖[18-19]。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

Sartorius BP211D電子天平北京塞多利斯儀器系統有限公司;KQ5200E超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;UV-1700紫外-可見分光光度儀日本島津公司;DIONEX-Summit P680ADGP-6型雙三元高效液相色譜儀美國戴安公司;DHG-903電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司;真空冷凍干燥箱wizard 2.0美國VirTis公司。

1.2實驗方法

1.2.2.1標準曲線的制作采用Folin-Ciocalteus法[23],以根皮苷為標準品[8],精確稱取12.25 mg根皮苷標準品,以70%乙醇溶解后定容至25 mL,即得到濃度490 μg/mL的儲備液。分別準確移取根皮苷儲備液0.2、1.0、3.0、5.0、7.0 mL于5支10 mL容量瓶,70%乙醇定容,得不同濃度根皮苷的標準溶液。取0.5 mL不同濃度根皮苷標準液和蒸餾水(做空白對照)于具塞試管中,依次加入6.5 mL蒸餾水和0.5 mL FC試劑,搖勻后靜置1 min,再加2.5 mL 10% Na2CO3溶液,搖勻,55 ℃保溫7 min,然后迅速冷卻至室溫,于760 nm波長下測定吸光度,并以根皮苷濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標進行線性擬合,得線性回歸方程y=0.0025x+0.0061,R2=0.9997,用于計算總多酚的質量濃度。

1.2.3大孔樹脂預處理新購的三種極性不同的大孔樹脂D-101、AB-8、NKA-9,用體積分數為95%的乙醇溶液密封浸泡24 h后,用超純水沖洗至無醇味備用。

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

1.2.5.3洗脫條件的確定按1.2.5.1和1.2.5.2所確定的上樣條件上樣并吸附平衡后,通過動態實驗,分別考察不同乙醇體積分數的洗脫劑(10%、30%、50%、70%、90%)、洗脫體積(1～14 BV)和洗脫流速(1、2、3、4 mL/min)對多酚純化的影響。

1.2.5.4最大上樣量的確定按1.2.5.1和1.2.5.2確定的上樣條件進行連續上樣,每一個BV收集一次流出液,按1.2.2.1方法測定流出液中總多酚的質量濃度,以上樣體積對總多酚的質量濃度作圖,繪制泄露曲線。

1.2.6樹脂重復利用實驗經純化使用過的D-101樹脂用體積分數為95%的乙醇溶液密封浸泡24 h后,用超純水沖洗至無醇味,再用5% HCl溶液密封浸泡2～4 h,用超純水沖洗至中性;最后用2% NaOH溶液密封浸泡2～4 h,用超純水沖洗至中性,然后按已確定的純化工藝進行重復實驗。重復10次,測定并計算所得純化物的量以及其中總多酚的含量,并以所得純化物中總多酚含量等對重復次數作圖。

1.3.1麥芽糖標準曲線的制作準確稱取1.00017 g麥芽糖,用蒸餾水溶解并定容至100 mL,配制成濃度為10.0017 mg/mL的麥芽糖儲備液。分別精密量取麥芽糖儲備液0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中,蒸餾水定容,得到不同濃度麥芽糖標準溶液。分別準確移取2 mL不同濃度麥芽糖標準溶液于25 mL容量瓶中,加入1% 3,5-二硝基水楊酸溶液2 mL,置于沸水浴中保溫5 min,待溶液冷卻至室溫后,加入蒸餾水定容至刻度,在540 nm處測定溶液吸光值,以麥芽糖質量濃度為橫坐標,對應吸光值作為縱坐標進行線性擬合,得到麥芽糖標準曲線為:y=0.0074x-0.0252,R2=0.9996,表明麥芽糖質量濃度在20.054～240.648 μg/mL范圍時,濃度與其對應吸光度值呈良好的線性關系,用于測定胰淀粉酶活力。

式(5)

式(6)

淀粉酶活性以每分鐘每克胰酶中淀粉酶催化作用下產生的麥芽糖的質量表示,即mg/min·g。

2　結果與分析

按1.2.4方法進行靜態吸附與解吸,并根據樹脂的吸附率和解析率選擇吸附和解析性能較好的樹脂。實驗測得各樹脂的靜態吸附率、解析率等的結果見表1。

表1　三種不同樹脂對栘葉多酚的靜態吸附與解析性能

Table 1　Results of adsorption and desorption for polyphenol from Docyniaindica(Wall.)Dcneby three macroporous resins

表1　三種不同樹脂對栘葉多酚的靜態吸附與解析性能

樹脂型號吸附率(%)吸附量(mg/g)解析率(%)多酚回收率(%)D-10196.60±0.296.28±0.0289.21±2.3386.17±2.38AB-895.20±0.336.19±0.0287.81±0.0483.60±1.86NKA-995.02±0.146.18±0.0184.46±1.1880.28±1.37

2.3上樣濃度對吸附的影響

考察不同上樣溶液質量濃度對吸附的影響,并以多酚回收率對上樣溶液中多酚的質量濃度作圖,結果見圖1。由圖1可知,當上樣溶液的質量濃度在5～25 mg/mL之間時,多酚回收率總體呈現增長的趨勢,但增長幅度不大,僅從82.34%±1.61% 增加到93.14%±1.05%,當上樣溶液質量濃度達到25 mg/mL時,多酚回收率出現最大值,為93.14%±1.05%。但隨著上樣溶液質量濃度的進一步增加,多酚回收率卻隨之下降,當上樣溶液質量濃度為30 mg/mL時,多酚回收率降至79.36%±1.27%。因此確定上樣溶液的最佳質量濃度為25 mg/mL。

圖1　上樣溶液質量濃度對樹脂吸附性能的影響Fig.1　Effect of sample concentration on adsorption properties

2.4上樣流速對吸附的影響

考察不同上樣流速對吸附過程的影響,并以吸附總量對上樣流速作圖,其結果見圖2。由圖2可知,隨著上樣流速的增大,D-101大孔吸附樹脂的吸附總量呈現下降趨勢,即流出液中總多酚的質量濃度逐漸增加。這是因為上樣流速越慢,多酚與樹脂的接觸時間越久,樹脂將多酚充分的吸附;而上樣流速越快,多酚與樹脂的接觸時間越短,導致樹脂吸附量降低。因此選擇1 mL/min作為上樣流速。

圖2　上樣流速對吸附的影響Fig.2　Effect of sample flow rate on flavonoids absorption

2.5乙醇體積分數的考察

考察不同體積分數的乙醇溶液對解析的影響,并以多酚回收率對乙醇的體積分數作圖,結果見圖3。由圖3可知,隨著乙醇體積分數的增加,多酚回收率也隨之增加,但當乙醇體積分數增加到50%以上時,增加的幅度并不大,僅從89.4%增加到96.2%。而當乙醇體積分數為50%時,已能將樹脂上近90%的多酚洗脫下來。繼續增加乙醇體積分數雖然能夠提高洗脫效果,但從經濟的角度考慮,選擇50%乙醇作為洗脫液,此時多酚的回收率為89.6%±2.6%。

圖3　乙醇體積分數對樹脂解析性能的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration on desorption properties

2.6洗脫流速對解析的影響

考察不同洗脫流速對解析的影響,并以多酚回收率對乙醇的洗脫流速作圖,結果見圖4。由圖4知,實驗所選各洗脫流速下,多酚的回收率均差距不大,均在90%左右。但隨著洗脫流速的增加,多酚回收率卻呈現下降的趨勢,這可能是因為洗脫流速越快,洗脫劑與多酚的作用時間越短,導致多酚無法被充分的洗脫下來。但洗脫流速太慢,將導致洗脫時間延長。因此,綜合考慮時間與成本等因素,選擇3 mL/min的洗脫流速作為最佳洗脫流速,此時多酚回收率為89.92%±1.92%。

圖4　洗脫流速對樹脂解析性能的影響Fig.4　Effect of elution flow rate on desorption properties

2.7最大上樣量確定

25 mg/mL的上樣溶液連續上樣,并按每1 BV收集流出液,按1.2.4方法計算流出液中多酚的質量濃度,并以多酚質量濃度對上樣量作圖,結果見圖5。由圖5可知,隨著上樣量的不斷增加,流出液中總多酚的質量濃度也隨之增加,當上樣量達到11 BV時,流出液中總多酚的質量濃度迅速增加。在上樣量達到21 BV以后時,流出液中總多酚的質量濃度達到最大值,為7.58 mg/mL,繼續增加上樣量,流出液中總多酚的質量濃度基本不變。綜合考慮,選擇上樣量為10 BV。

圖5　總多酚的泄露曲線Fig.5　The leakage curve of polyphenols

2.8洗脫體積對解析的影響

圖6　洗脫曲線Fig.6　Dynamic desorption curve

2.9樹脂重復利用實驗

將D-101樹脂回收并經過10次吸附-解析-再生的重復操作,以所得純化物質量、純化物中多酚和根皮苷含量對重復次數作圖,結果見圖7。

圖7　D-101樹脂重復使用性能實驗Fig.7　Reusaility of D-101

圖8　栘葉多酚提取物及純化物對胰淀粉酶的抑制Fig.8　Polyphenols of extract and purification from Docyniaindica(Wall.) Dcne with pancreatic amylase inhibitory effect

3　結論

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Study on polyphenol purification by macroporous resin and inhibition activity to pancreatic amylase of polyphenol fromDocyniaindica(Wall.)Dcne leaves

CHEN Jiang1,ZHANG Xiao-yu1,*,LIU Gang1,WANG Zhan-guo2,LIU Hai-xia1

(1.College of Life Science,Sichuan Normal University,Chengdu 610100,China;2.School of Medical & Nursing,Chengdu University,Chengdu 610100,China)

To propose an optimal purification process for polyphenol extracted fromDocyniaindica(Wall.)Dcne leaves and investigate the inhibition of pancreatic amylase before and after purification. Macroporous resins D-101 was found more suitable to purify polyphenols by comparing their static adsorption and desorption capacities with those of two other kinds of macroporous resin. The purification process of D-101 was determined after static and dynamic experiment. When the D-101 was adsorbed with the maximum sample volume of 10 BV sample solution containing 25 mg/mL extractive at a rate of 1 mL/min,and desorpted with 8 BV of 50% ethanol at a flow rate of 3 mL/min,the content of the total polyphenol could be increased from 39.7% to 91.89%.The method proved to be simple and feasible for purification of total polyphenols extracted fromDocyniaindica(Wall.)Dcne leaves. After purification,the inhibitory rate of total polyphenols extracted fromDocyniaindica(Wall.)Dcne leaves increased,and the inhibition rate before and after purification was higher than that of 100 mg/mL rhubarb extract on pancreatic amylase,indicating that polyphenols ofDocyniaindica(Wall.)Dcne leaves had obvious inhibiting effect on pancreatic amylase,which the purification can improve.

Docyniaindica(Wall.)Dcne;polyphenol;macroporous resin;purification;pancreatic amylase

2015-11-27

陳江(1991-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：食品非營養類物質的生物活性與功能,E-mail：18328616954@163.com。

張曉喻(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：食品非營養類物質的生物活性與功能,E-mail：zhangxy2005@126.com。

四川省科技廳科技支撐項目(2016SZ0026)；四川師范大學校級重點培育項目(13ZDL11)；四川省教育廳項目(14ZA0025)；攀枝花市科技局項目(2014CY-S-8)；西昌市教科和科學計劃局2014年度科技項目；四川師范大學大精基金項目(DJ2013-02,DJ2014-13,DJ2015-04)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)18-0143-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.019