根霉纖溶酶的酶學性質研究

李長偉，邵昕昕

牡丹江友搏藥業有限責任公司

根霉纖溶酶的酶學性質研究

李長偉，邵昕昕

牡丹江友搏藥業有限責任公司

目的：對根霉cw-1液體發酵生產的纖溶酶進行酶學性質初探，為天然溶栓藥物的開發奠定理論基礎。方法和結果：由SDS-PAGE測定該根霉纖溶酶為單一組分，相對分子量為32.5kDa；IEF電泳測定其等電點為8.3；該纖溶酶是一種糖蛋白，總含糖量為2.2%（w/v）。該纖溶酶可依次降解人血纖維蛋白的α、β和γ鏈。最適作用溫度和pH分別為40oC和7.5；在pH5.8～10范圍內，37℃保溫24h，殘余纖溶酶酶活在80%以上。結論：本實驗研究的根霉纖溶酶可有效降解人血纖維蛋白，并且在人的正常體溫下具有良好穩定性，顯示了良好的溶栓藥物特性。

根霉；纖溶酶；酶學性質；溶栓

血栓性疾病是嚴重危害人類健康的疾病之一，利用溶栓劑治療血栓病的溶栓療法被認為是最為有效的方法之一。微生物纖溶酶作為天然來源的溶栓藥物，具有重要的臨床應用前景及價值［1］。本文報道一種來源于根霉cw-1液體發酵的纖溶酶，對該纖溶酶的基本酶學性質進行研究，為進一步溶栓藥物的開發奠定研究基礎。

1　材料與方法

1.1儀器、材料與試劑

HASUC恒溫搖床；根霉纖溶酶純酶由根霉cw-1菌株分離純化制得；血纖維蛋白原、尿激酶、凝血酶購自上海經科化學試劑有限公司，其余化學試劑均為國產分析純。

1.2纖溶酶活性測定

采用血纖維蛋白平板法測定纖溶酶活力［2］。

1.3根霉纖溶酶相對分子質量測定

應用SDS-PAGE法測定脈孢霉纖溶酶相對分子質量。選擇凝膠濃度為12%（w/v）的分離膠，5%（w/v）的濃縮膠，交聯度為2.6%，進行垂直電泳。

1.4根霉纖溶酶等電點測定

應用等電聚焦電泳（IEF）測定根霉纖溶酶的等電點。凝膠濃度T=7.5%，交聯度C=3%，40%載體兩性電解質，進行水平電泳。

1.5糖蛋白定性及定量實驗

應用莫氏（Molish）試驗對根霉纖溶酶進行糖蛋白定性實驗；采用蒽酮比色法對含糖量進行定量測定。

1.6根霉纖溶酶降解人血纖維蛋白實驗

將2%人血纖維蛋白（溶于pH7.5的50mMTris-HCL緩沖液）200μL與60μL 0.01mg/mL的酶液混勻置于離心管中于37oC分別保溫5min、30min、1h、2h、4h和6h，以人血纖維蛋白作對照，進行SDS-PAGE檢測。

1.7溫度及pH對根霉纖溶酶活性的影響

取一定量纖溶酶純酶分別置于不同溫度及pH條件下（圖1所示），測定相對酶活，以最高酶活為100%；分別將纖溶酶純酶置于不同溫度及pH條件下，分別放置2h、4h、12h和24h后測定殘余酶活，以初始酶活為100%。

圖1　根霉纖溶酶最適作用溫度（a）及pH（b）

2　結果

2.1根霉纖溶酶的分子量及等電點

SDS-PAGE測定該纖溶酶的相對分子質量約為32.5kDa；IEF測定其等電點為8.3。

2.2根霉纖溶酶糖蛋白測定結果

莫氏實驗結果顯示該纖溶酶液面交界處有紫色環出現，說明該酶蛋白中有可能有糖存在；進一步應用蒽酮比色法確定了該蛋白含糖量為2.2%（w/v）。

2.3根霉纖溶酶降解人血纖維蛋白情況

本實驗用SDS-PAGE檢測該纖溶酶對人血纖維蛋白的降解規律，結果顯示，作用5min后α鏈已經完全降解，1h后β鏈完全降解，2h后γ鏈降解完畢，這一降解順序與人纖溶酶降解纖維蛋白各亞基的情況是一致的。

2.4根霉纖溶酶的最適溫度、pH及其穩定性

實驗結果顯示，在pH7.5條件下，該纖溶酶的最適作用溫度為40oC；在40oC下測定該酶的最適pH為7.5（圖1所示）。同時，在pH5.8～10范圍內，37oC保溫24h，該纖溶酶殘余酶活在80%以上。

3　討論

本實驗對根霉cw-1纖溶酶的純酶進行酶學性質研究，該酶的最適作用溫度及pH接近人體環境，并且在人體正常環境下測定該酶的穩定性良好。另外，該酶對人血纖維蛋白三個亞基的降解順序與人纖溶酶一致，可見該根霉纖溶酶在性質上具有開發成溶栓藥物的潛力。

［1］張雯舒，劉曉蘭，鄭喜群，等.蛹蟲草無性型深層培養液中纖溶酶的分離純化和酶學性質研究［J］.微生物學通報，2012（12）∶1787-1795.

［2］ASTRUP T，MULLERTZ S.The fibrin plate methed for estimating fibrinolytic activity［J］.Arch Biochem Biophys，1952（40）∶346-351.