單增李斯特菌便捷檢測試紙的制備及檢測效果

鄭曉風，韓　勇，劉英玉，張軍濤，張　琦，張曉紅，姚　剛,

（1.新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆烏魯木齊市畜牧草原工作站，新疆 烏魯木齊 830000）

單增李斯特菌便捷檢測試紙的制備及檢測效果

鄭曉風1，韓勇2，劉英玉1，張軍濤1，張琦1，張曉紅1，姚剛1,*

（1.新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆烏魯木齊市畜牧草原工作站，新疆 烏魯木齊 830000）

目的：研究一種快速、便捷檢測食品中單增李斯特菌的方法，擬對本實驗室制備的單增李斯特菌快速檢測試紙（Listeria monocytogenes-fast test paper，LM-FTP）（專利受理號：201510274726.9）進行檢測效果評價。方法：采集肉樣、乳樣、水樣和蔬菜，用LM-FTP進行檢測，并與市售單增李斯特菌檢測試紙片（3M PetrifilmTM）進行比對實驗。結果：LM-FTP的檢測特異性為100%，檢測限為2.1×104CFU/mL。增菌培養到報告結果只需5.5 h。LM-FTP和3M PetrifilmTM檢測都可對樣品完成檢測，對農貿市場畜產品及蔬菜檢測，二者符合率為75%，對超市同類食品檢測，二者符合率為62.5%；對超市熟食檢測時，二者符合率為93.75%。結論：與市售3M Petrifi lmTM檢測方法相比，LM-FTP檢測試紙制備簡單，操作便捷，較3M PetrifilmTM的24 h報告結果更節省時間，但在檢測靈敏度方面有一定差距，尚需進一步研究改進。

單增李斯特菌；酶底物法；快速檢測試紙

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是常見的食源性致病菌，它已于2002年被世界衛生組織列為第四大重要的食源性致病菌［1］。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，主要是通過污染乳制品、畜禽產品、生熟肉、蔬菜引起發病［2-4］。人和動物誤食后可引起胃腸炎、敗血癥等，對免疫力低下者如腫瘤、艾滋病的更容易引起感染［5-10］。據美國疾病預防與控制中心報道，全美國每年有2 000多例嚴重的病癥是由單增李斯特菌引起的［11］，國內目前還沒有相關報道［12］，但是張淑紅等對河北省2005—2013年食品中檢出了單增李斯特菌［13］。李斯特菌病的死亡率可達20%～70%［14-16］。

縱觀各國單增李斯特菌檢測技術，主要包括傳統的生化培養技術、免疫學檢測技術、液相色譜技術以及分子生物學技術等。傳統的生化培養技術主要包括：增菌、分離和鑒定3 個環節，因此耗時、耗力，常需要6～7 d出結果［17］。免疫學檢測技術以抗原抗體免疫為基礎，制備特異性克隆抗體檢測細菌，具有高特異、快速的特點得到青睞，但抗體種類繁多，對專業技術人員和儀器設備依賴程度高。分子生物學檢測技術研究熱點是有堿基配對原理的核酸探針雜交技術、快速擴增目的基因為檢測原理的聚合酶鏈式反應技術等［18］，具有靈敏度高、特異性好等優點，但所需儀器昂貴，對實驗室條件要求高，難以滿足畜產品生產一線對食源致病微生物的源頭檢測需求，特別是我國欠發達地區的現場檢測需求問題更加凸顯。由于我國鮮少有與本研究原理相關的檢測技術，因此，擬采用美國3M公司生產的3M PetrifilmTM和本室制備的LM-FTP檢測試紙進行檢測效果比對實驗，以期研發出具有自主知識產權的單增李斯特菌便捷檢測技術。

1　材料與方法

1.1材料與菌株

牛肉、雞肉、羊肉、散稱鮮牛乳、青菜等 市購；國產品牌純牛奶、牛肉、培根肉、三文魚、火腿、雞腿肉、精腿肉、蛋黃、礦泉水、純凈水等來自超市的熟食和瓶裝水。

標準單增李斯特菌CICC21633菌株、沙門氏菌菌株、大腸桿菌菌株 中國工業微生物菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌 新疆農業大學微生物實驗室分離鑒定并保存。

1.2試劑與儀器

腦心浸液培養基（CM917）、腦心浸液瓊脂（CM918） 北京陸橋技術有限責任公司；營養肉湯、營養瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉天津市盛奧化學試劑有限公司；單增李斯特菌檢測試紙本實驗室自制；Whatman濾紙 英格蘭梅德斯國際濾紙有限公司；環境單增李斯特菌檢測試紙片 美國3M公司。

電熱恒溫培養箱 長沙市西區起重電器廠；SJ-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；PHS-3C數字式pH計 上海精賢光電科技有限公司；紫外-可見光分光光度計 德國Eppendorf公司；PL203電子天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；優普系列超純水機 成都超純科技有限公司。

1.3方法

1.3.1單增李斯特菌檢測試紙制備

根據單增李斯特菌產生的酶遇其底物顯色的原理，采用單因素試驗［19］對最佳底物濃度、pH值、反應時間、反應溫度等進行篩選，將篩選出的最佳條件再采用正交試驗設計［20］進行單增李斯特菌檢測最佳顯色反應條件的優化篩選。將Whatman濾紙裁剪成長×寬為4 cm×1 cm的試紙條，高壓滅菌，無菌操作包被底物，制備成單增李斯特菌檢測試紙（LM-FTP）（已經申請專利，專利受理號：201510274726.9），見圖1，4 ℃密封保存。

圖1　1LMLM-FTP制備示意圖Fig.1　Scheme of LM-FTP preparation

1.3.2樣品前處理

將待檢水樣、肉樣、乳樣等按GB 4789.30—2010《食品微生物學檢驗：單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》［21］進行樣品的前處理。實驗前將高壓過的剪刀、平皿、鑷子等試驗器材放入無菌操作臺內進行紫外照射。然后用滅菌后的剪刀在操作臺內取肉樣25 g進行剪碎，將剪碎好的樣品轉入盛有225 mL生理鹽水的錐形瓶內進行1∶10混勻并用無菌封口膜進行封口，為了充分混勻肉樣和生理鹽水還需要手動混勻并且標記。乳樣和水樣是用1 mL的移液槍吸取25 mL與生理鹽水進行1∶10混勻最后再將錐形瓶放置37 ℃電熱恒溫培養箱內培養24 h。

1.3.3樣品增菌

24 h后取出錐形瓶，在無菌操作臺內，用槍吸取1 mL樣品處理液加入9 mL腦心浸液培養基內并輕輕混勻，在37 ℃恒溫搖床上，以180～190 r/min的轉速，振蕩培養5 h。

1.3.4單增李斯特菌檢測試紙特異性檢測

將鑒定完全的沙門氏菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌進行增菌后，滴加在LM-FTP檢測試紙上，同時用單增李斯特菌顯色結果做對比，從而確定LM-FTP的特異性。

1.3.5單增李斯特菌檢測試紙靈敏度檢測

按照2、4、10、100 倍的比例將增菌培養后的單增李斯特菌進行倍比稀釋，取稀釋好的菌液滴加到LM-FTP上，并對其靈敏度與3M Petrifi lmTM靈敏度對比研究。

1.3.6單增李斯特菌檢測試紙的檢測

37 ℃恒溫搖床振蕩培養5 h后移出離心管，進行檢測。每平皿內放3 片LM-FTP檢測試紙，滴加富集5 h后的菌液。結果判定：觀察顯色反應，若顯藍色，判定為單增李斯特菌陽性結果，不顯藍色則判定為陰性。

1.3.7環境單增李斯特菌檢測試紙片的檢測

按照3M PetrifilmTM的說明書進行操作，用1 mL的移液器吸取3 mL富集5 h后的菌液，垂直均勻的滴加在測試片中央，靜置10 min，以使膠體凝固。每個樣品增菌液滴加2 片測試片，以做重復。同時做1 片陰性對照測試片。置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h。結果判定：觀察紫紅色菌落的存在與否，若測試片上出現紫紅色菌落，則表示檢出單增李斯特菌；若測試片上未出現紫紅色菌落，則表示未檢出單增李斯特菌。

1.3.8符合率計算

2　結果與分析

2.1單增李斯特菌檢測試紙特異性檢測結果由表1和圖2判定結果：只有單增李斯特菌顯藍色，

表1　1LM-FTP特異性檢測結果Table1　Specificity of LM-FTP

圖2　2LM-FTP特異性檢測結果Fig.2　Specificity of LM-FTP

其他的3 株菌不顯色，特異性100%。

2.2單增李斯特菌檢測試紙靈敏度檢測結果

表2　LM-FTP靈敏度檢測結果Table2　Sensitivity of LM-FTP

圖3　3LMLM-FTP靈敏性檢測結果Fig.3　Sensitivity of LM-FTP

圖4　3MPetrifilmTM靈敏性檢測結果Fig.4　Sensitivity of 3M PetrifilmTM

由表2和圖3、4結果得知，LM-FTP的檢測最低限為2.1×104CFU/mL，3M Petrifi lmTM檢測最低限為1 CFU/mL。

2.3農貿市場和超市畜產品結果

本實驗室自制LM-FTP與3M Petrifi lmTM的檢測符合率比較表明，農貿市場畜產品及蔬菜檢測符合率為75%，而超市同類食品檢測符合率為62.5%。

表3　農貿市場與超市畜產品樣品檢測結果比較Table3　Comparison of results obtained using LM-FTP and 3M PetrifilmTM for the detection of samples collected from farmer s market and supermarket

如圖5～7所示，LM-FTP檢測到單增李斯特菌，則試紙片顯藍色（圖中均未顯示顏色，下同）；反之，試紙片不顯色。3M PetrifilmTM檢測片檢測到單增李斯特菌則會出現紫紅色菌落；反之，則未出現紫紅色菌落。

圖 5 農貿市場LM-FTP和3M PetriffiilmTM檢測結果Fig. 5 Results of LM-FTP and 33MM PetrifilmTMfor samples collected from farmer’s market

圖6　超市畜產品LM-FTP檢出結果Fig.6　Results of LM-FTP detection for livestock samples collected from supermarket

圖7　超市畜產品3M PetrifilmTM檢出結果Fig.7　Results of 3M PetrifilmTMdetection for livestock samples collected from supermarket

2.4超市熟食檢測結果

LM-FTP與3M PetrifilmTM在對超市熟食檢測檢測結果對比結果發現，二者的符合率為93.75%（表4）。LMFTP與3M Petrifi lmTM具體檢測結果如圖8、9所示。

表4　超市熟食檢測結果對比Table4　Comparison of results obtained using LM-FTP and 3M PetrifilmTMfor the detection of supermarket delis

圖8　超市熟食LM-FTP檢測結果Fig.8　Results of LM-FTP detection for supermarket delis

圖9　超市熟食3M PetrifilmTM檢測結果Fig.9　Results of 3M PetrifilmTMdetection for supermarket delis

3　討 論

目前，單增李斯特菌是李斯特屬中唯一引起人和動物患病的一種食源性致病菌［22］，因此能夠實現對該菌的快速檢測技術我國食品安全控制的首要任務之一。崔煥忠等［23］研究的膠體金檢測試紙檢測食品中單增李斯特菌而制備的特異性抗體，具有快速、特異性強等特點，但是單抗制備昂貴，所以進行食品樣品檢測費用較高，同時該技術對食品中單增李斯特菌檢測最低限為3.9×105CFU/mL，而LM-FTP的檢測限為2.1×104CFU/mL，相比較而言，LM-FTP靈敏度較高，能夠滿足食品中單增李斯特氏菌檢測的需要。分子生物學檢測中李敏等［24］用免疫磁珠分離PCR方法對食品中單增李斯特菌快速檢測，具有極好的特異性、靈敏性，但存在所需儀器設備昂貴且對操作技術要求高等缺陷，在食品樣品中無法實現大批量的檢測。毛燕等［25］將免疫磁珠技術與顯色培養基相結合檢測牛乳中的單增李斯特菌的實驗結果準確、直觀，但是需要4～7 d報告結果，不利于快速檢測。

美國、歐盟等發達國家對單增李斯特菌快速檢測方法已經相對成熟，已開發出各種快檢系統和自動化儀器，流式細胞技術只需要1 min即可完成定量分析，但儀器投入昂貴，提高了檢測成本［14］。目前市場上較實用的3M PetrifilmTM試紙片，需要依賴國外進口，且價格平均45～50 元。而我國對單增李斯特菌研究的經驗和方法起步相對較晚［26］，從而表明我國自主研發快速檢測技術的必要性。

本實驗室研制的試紙是利用單增李斯特菌合成酶遇特異的底物產生肉眼可見的顯色反應，完成對該菌的快速檢測，無需任何儀器即可判定結果，簡化了操作步驟，也減少了專業技術人員的指導。LM-FTP前期制備的理念來自微流控芯片技術，它是以紙張作為材料，具有質量輕、易儲藏、便于銷毀、價格低廉等優點。LM-FTP只需要滴加液體40 μL，并且顯色結果可以長期保存。LM-FTP的研制有利于食品生產一線，特別是偏遠地區檢測技術薄弱地方進行食源性致病微生物的初步普查與檢測，為食品中單增李斯特菌污染控制提供便捷技術支撐。然而，由于LM-FTP與3M Petrifi lmTM檢測試紙比較而言，在熟食品檢測中符合率較高，達到93.75%，但在農貿市場畜產品及蔬菜檢測符合率為75%，而超市同類食品檢測符合率為62.5%，尚存在較大差距，其主要原因可能在于熟食是經過高溫滅菌環節，而單增李斯特菌是不耐37 ℃高溫的，證明熟食中含菌量低，LM-FTP和3M PetrifilmTM都不能檢測出，仍需要對LM-FTP的靈敏度進一步研究改進。

4　結 論

與市售3M PetrifilmTM檢測方法相比，本實驗室自制的LM-FTP制備簡單，操作便捷，從增菌培養到報告結果時間短，只需要5.5 h，即可呈現肉眼可見的顯色反應，較3M PetrifilmTM24 h報告結果更節省時間。但與市售3M PetrifilmTM相比，在檢測靈敏度方面尚需進一步研究改進提高。

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Preparation and Applicability of a Simple and Fast Test Strip to Detect Listeria monocytogenes

ZHENG Xiaofeng1, HAN Yong2, LIU Yingyu1, ZHANG Juntao1, ZHANG Qi1, ZHANG Xiaohong1, YAO Gang1,*
（1. College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China；2. ürümqi Station of Animal Husbandry and Pasture of Xinjiang Province, ürümqi 830000, China）

Purpose： In the present study, a paper-based test strip for the fast and simple detection of foodborne L. monocytogenes （LM） was prepared and named as LM-FTP （Patent Acceptance Number： 201510274726.9）, and its performance was evaluated. Methods： The performance evaluation was carried out in comparison with 3M Petrifi lmTMby using them to detect samples of meat, milk, drinking water and vegetable collected from farmer's market and supermarket. Results： The specifi city of LM-FTP was 100% with a limit of detection of 2.1 × 104CFU/mL, and the detection process from bacterial enrichment to obtainment of analytical results took about 5.5 hours. Both LM-FTP and 3M Petrifi lmTMcould enable the detection of the samples we tested. The coincidence rate between the results obtained using LM-FTP and 3M Petrifi lmTMfor the detection of livestock products and vegetables from farmer's market was about 75%, whereas that for those from supermarket was about 62.5%. In addition, the coincidence rate between the results of both methods for supermarket delis was about 93.75%. Conclusions： LM-FTP is simpler to prepare, easier to use, and time saving compared with 3M Petrifi lmTM, but it was inferior to 3M Petrifi lmTMin terms of sensitivity. Therefore, LM-FTP remains to be further improved.

Listeria monocytogenes； enzyme substrate method； rapid test strip

10.7506/spkx1002-6630-201620033

S852.612

A

1002-6630（2016）20-0191-07

鄭曉風, 韓勇, 劉英玉, 等. 單增李斯特菌便捷檢測試紙的制備及檢測效果［J］. 食品科學, 2016, 37（20）： 191-197.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620033. http：//www.spkx.net.cn

ZHENG Xiaofeng, HAN Yong, LIU Yingyu, et al. Preparation and applicability of a simple and fast test strip to detect Listeria monocytogenes［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 191-197. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620033. http：//www.spkx.net.cn

2016-02-01

新疆維吾爾自治區高技術發展計劃項目（201411105）；新疆維吾爾自治區研究生教育創新計劃-新疆研究生科研創新項目（XJGRI2015093）

鄭曉風（1991—），女，碩士研究生，研究方向為畜產品質量安全。E-mail：1439831292@qq.com

姚剛（1959—），男，教授，博士，研究方向為動物生長發育調控及畜產品質量安全。E-mail：yaogang516@163.com