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大籽蒿精油化學(xué)成分及其抗菌抗氧化活性

2016-11-07 08:35:26李海亮陳海魁徐福利王渭玲李繼霖
食品科學(xué) 2016年20期

李海亮,陳海魁,徐福利,3,,王渭玲,李繼霖

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,寧夏 銀川 750021;3.中國科學(xué)院水利部水土保持研究所,陜西 楊凌 712100;4.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

大籽蒿精油化學(xué)成分及其抗菌抗氧化活性

李海亮1,陳海魁2,*,徐福利1,3,*,王渭玲4,李繼霖4

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,寧夏 銀川 750021;3.中國科學(xué)院水利部水土保持研究所,陜西 楊凌 712100;4.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

采用水蒸氣蒸餾法提取采自西藏地區(qū)藏藥大籽蒿的精油,通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析鑒定其化學(xué)成分,采用峰面積歸一化法確定各成分的相對含量;并對大籽蒿精油體外抑菌能力和抗氧化能力進(jìn)行測定。大籽蒿精油中共鑒定48 種化合物,占精油總量的95.36%,主要成分為紅沒藥醇、蘭香油奧、α-水芹烯、棕櫚酸和薰衣草醇等;體外抑菌結(jié)果表明,大籽蒿精油對枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌和新型隱球菌具有較強(qiáng)的抑菌效果,而對大腸桿菌具有較弱抑菌效果;體外抗氧化活性結(jié)果表明大籽蒿精油對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽自由基和羥自由基具有一定的的清除能力,且清除效果強(qiáng)于VC。關(guān)鍵詞:大籽蒿;精油;抗氧化活性;抑菌活性

蒿屬(Artemisia L.)為菊科一、二年生或多年生草本植物,全球約有500余種,我國有180余種[1-2],各省均有分布;西藏分布有57 種,6變種,其中15 種為西藏特有種。蒿屬在我國為一種“藥食兩用”的民族傳統(tǒng)中藥材,具有清熱解毒、抗菌消炎、祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)、活血、止血、抗艾滋病等功效[3-7]。

精油也稱揮發(fā)油,不同植物的精油具有不同的功效,如:薰衣草精油可用于治療感冒、鼻竇炎和鼻喉黏膜炎;蒿屬植物和茶樹精油具有較強(qiáng)的抑菌和驅(qū)蟲作用;柴胡精油所制備的注射液具有退熱作用;丁香精油有局部麻醉止痛作用;薄荷精油可用于治療應(yīng)激性腸綜合征、非潰瘍性消化不良和神經(jīng)性頭痛[8-9]。蒿屬植物富含揮發(fā)油,其中含有萜烯類、酯類、醇類等化學(xué)物質(zhì),具有較強(qiáng)的生物活性。研究表明蒿屬植物精油對金黃色葡萄球、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、新型鏈球菌等具有較強(qiáng)的抑菌作用,且具有很強(qiáng)的體外抗氧化作用[10-12]。而植物精油獨特的作用使它走進(jìn)人們的日常生活,人們利用薰燈或薰?fàn)t將精油揮發(fā)出來,達(dá)到凈化空氣的目的,且要比使用市售香水更利于健康;而作為一天然香料原料,茴香油、肉桂皮油和白蘭油等70多種植物精油廣泛用于日化工業(yè)。

大籽蒿(Artemisia sieversiana)藏語稱“坎巴”,全株或地上部分供藥用、食用。研究表明大籽蒿具有抗缺氧、抗癌的作用;在高原地區(qū)大籽蒿可用于治療紫外線輻射所引起的灼傷[13]。劉群等[14]研究表明,采自于長春地區(qū)的大籽蒿地上部分精油中主要化學(xué)成分為1,8-桉葉油素、丁香烯、丁香烯和樟腦;但樟腦對人體肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)均具有較強(qiáng)的毒性。Vasylievna等[15]研究發(fā)現(xiàn)分布于俄羅斯布里亞特地區(qū)的大籽蒿地上部分精油中主要成分為蘭香油奧,大根香葉烯D、紅沒藥醇、neryl-3-methylbutanoate和neryl-2-methylbutanoate等。可見植物精油化學(xué)成分因環(huán)境的不同其中化學(xué)成分差異極大。

西藏因其高海拔、低氧的特殊環(huán)境使得植物的化學(xué)成分產(chǎn)生多樣化,而目前筆者鮮見到國內(nèi)外關(guān)于西藏高原生境中大籽蒿精油化學(xué)成分分析和精油生物活性的相關(guān)研究。本實驗采用水蒸氣蒸餾法提取采自西藏地區(qū)的大籽蒿全株精油,采用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用技術(shù)分析鑒定大籽蒿精油化學(xué)成分,并對其體外抑菌活性、抗氧化活性進(jìn)行測定,以期為合理開發(fā)、利用大籽蒿這一民族傳統(tǒng)中藥資源提科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料、試劑、菌種與儀器

大籽蒿于盛花期(2014年9月末至10月初)采自于西藏拉薩地區(qū),經(jīng)甘肅省張掖市河西學(xué)院高海寧副教授鑒定為大籽蒿(Artemisia sieversiana)干燥全株。

C8~C24正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt,ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美國Sigma公司;VC(分析純) 上海阿拉丁試劑公司;氨芐青霉素(ampicillin,AMP)、吐溫-280、胰蛋白胨、酵母提取物、氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇、無水硫酸鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀等均為國產(chǎn)分析純。

枯草芽孢桿菌(B. s u b t i l i s)、大腸桿菌(E. coli)、糞腸球菌(E. faccalis)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、新型隱球菌(C. neoformans) 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)公司。

KDM調(diào)溫電熱套 山東鄴城華魯電熱儀器有限公司;Voyager型GC/MS聯(lián)用儀 美國Finnigan公司;Clevenger type蒸餾裝置 實驗室組裝;722S分光光度計、FA2104N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1大籽蒿精油的提取

將采集的新鮮植物材料去雜后陰干;稱量取適量植物材料用Clevenger type蒸餾裝置(含直型冷凝管、油水分離器等)蒸餾3~4 h時,至精油餾出量不再增加;收集油水分離器中上層的油層,得到具有特殊香氣的大籽蒿精油,用無水硫酸鈉干燥后于-20 ℃密封保存。

1.2.2GC-MS分析條件

G C條件:A g i l e n t H P-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣:高純氦氣;載氣壓力:0.25 MPa;分流進(jìn)樣,分流比:10∶1;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;起始溫度60 ℃,保留2 min,以10 ℃/min升溫至250 ℃維持10 min至分析完成。

MS條件:離子源:電子電離源;離子溫度:200 ℃;電子能量:07 eV;燈絲電流:80 μA;掃描范圍:41~450 u;掃描間歇:0.5 s。

1.2.3體外抑菌檢測

菌懸液的制備[16]:菌株經(jīng)活化后接種于液體Luriabertani(LB)培養(yǎng)液中,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)隔夜(12 h)后接種于新LB培養(yǎng)液中,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為0.3;按1∶50的比例,用液體LB培養(yǎng)基稀釋為濃度約為107CFU/mL的菌懸液。

大籽蒿精油抑菌劑的制備[17]:植物精油以LB培養(yǎng)液(含0.5%吐溫280)為溶劑,按8∶92(V/V)配成大籽蒿精油溶液;最高質(zhì)量濃度視大籽蒿精油溶解度進(jìn)行調(diào)整(精油須完全溶解,精油實際最高實驗質(zhì)量濃度為20 μg/mL)。

最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測定[18]:利用微量稀釋法測定植物精油MIC,略作改動。每孔加入100 μL的液體培養(yǎng)基,再加入100 μL相應(yīng)的精油抑菌劑,最后加入100 μL菌懸液(每孔菌量為106CFU/mL)。37 ℃培養(yǎng)24 h,觀測細(xì)菌的生長情況,以無菌落生長的最低濃度為MIC,以LB培養(yǎng)液作空白對照、AMP(最高質(zhì)量濃度250 μg/mL)作陽性對照、菌液作陰性對照。每個菌種設(shè)3 個重復(fù),MIC取平均值。

1.2.4抗氧化活性測定

1.2.4.1DPPH自由基清除能力測定

參考王茜等[19]方法,略作改動。用無水乙醇配制質(zhì)量濃度分別為20、50、100、150、200 μg/mL的大籽蒿精油溶液,配制同樣質(zhì)量濃度的VC溶液作為對照樣品溶液。取1 mL樣品溶液和1 mL濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液,混勻后室溫暗反應(yīng)30 min,以無水乙醇作參比,測定517 nm波長處的吸光度A,同樣測定1 mL樣品溶液與1 mL無水乙醇混合后517 nm波長處的吸光度A0,再測定1.0 mL DPPH溶液與10 mL無水乙醇混合液在517 nm波長處的吸光度A1(重復(fù)3 次),按式(1)計算清除率:

1.2.4.2ABTS+·清除能力測定

參照Cristina等[20]方法配制2 mmol/L ABTS溶液,吸取50 mL ABTS溶液與200 mL 70 mmol/L K2S2O8溶液混合,室溫避光放置12~16 h后得ABTS+·溶液。用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS,pH 7.0~7.2)將A B T S+·溶液稀釋至在7 3 4 n m波長處吸光度為0.70±0.02。用無水乙醇配制質(zhì)量濃度分別為20、50、100、150、200 μg/mL的大籽蒿精油溶液,配制同樣質(zhì)量濃度的VC溶液作為對照樣品溶液。取0.1 mL樣品溶液,加入1.9 mL ABTS+·溶液,在734 nm測其吸光度(重復(fù)3 次),按式(2)計算清除率:

式中:A0為ABTS+·溶液的吸光度;A為加大籽蒿精油溶液后的吸光度。

1.2.4.3羥自由基清除能力的測定[21-22]

用無水乙醇配制質(zhì)量濃度分別為20、50、100、150、200 μg/mL的大籽蒿精油溶液,配制同樣質(zhì)量濃度的VC溶液作為對照樣品溶液。取樣品溶液2 mL,依次加入1.0 mL 0.01 mol/L FeSO4、1.5 mL 10% H2O2溶液,混勻靜置10 min,再加入2 mL 0.01 mol/L水楊酸溶液,混勻后37℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min,510 nm波長處測其吸光度。分別以1.5 mL蒸餾水代替雙氧水、2 mL無水乙醇代替樣品同法測得的吸光度(重復(fù)3 次),按式(3)計算清除率:

式中:A0為空白對照液中的吸光度;A1為樣品溶液的吸光度;A2為未加過氧化氫溶液樣品的吸光度。

大籽蒿精油對DPPH自由基、ABTS+·和羥自由基的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)采用SPSS 19.0進(jìn)行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1大籽蒿精油化學(xué)成分分析

利用GC-MS聯(lián)用儀計算機(jī)NIST-MS譜庫自動檢索各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù),并對結(jié)果參考有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)圖譜和化合物保留指數(shù)進(jìn)行核對和補(bǔ)充檢索,經(jīng)峰面積歸一化法計算,得出各組分的相對含量[23]。化合物保留指數(shù)(retention index,RI)按式(4)計算:

式中:t'R為校正保留時間;z和z+1分別為目標(biāo)化合物(x)流出前后的正構(gòu)烷烴所含碳原子的數(shù)目。

于上述實驗條件下對大籽蒿精油成分用GC-MS法進(jìn)行分析,得總離子流圖,見圖1;大籽蒿精油化學(xué)成分及其相對含量見表1。由表1可見,大籽蒿精油中共鑒定49 種化合物,占精油總量的95.36%。其中主要化學(xué)成分為紅沒藥醇(34.47%)、蘭香油奧(23%)、α-水芹烯(5.22%)、棕櫚酸(3.85%)、薰衣草醇(3.45%)等。

圖1 大籽蒿精油成分總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of essential oil from A. sieversiana

表1 大籽蒿精油化學(xué)成分及含量Table1 Chemical composition of essential oil from A. sieversiana

續(xù)表1

2.2大籽蒿精油的抑菌作用

抑菌實驗結(jié)果的見圖2,結(jié)果統(tǒng)計見表2,大籽蒿精油因乳化稀釋處理后顏色較淺,故大籽蒿精油處理和AMP處理彼此互為背景,抑菌質(zhì)量濃度梯度抑菌現(xiàn)象以肉眼觀察為準(zhǔn)。從表2可以看出:供試大籽蒿精油對除E.coli外的其他4 種菌(B. subtilis、E. faccalis、S. aureus、C. neoformans)均有不同程度的抑制作用;供試大籽蒿精油在實驗質(zhì)量濃度內(nèi)對E.coli抑制作用不明顯,而對C. neoformans的抑制作用最明顯,MIC為5.5 μg/mL;C. neoformans因?qū)貯MP不敏感型,在實驗質(zhì)量濃度內(nèi)未能起到抑制作用。

圖2 大籽蒿精油抑菌效果Fig.2 Antimicrobial effect of the essential oil on different bacteria

表2 大籽蒿精油的MMIICCTable2 MIC values of the essential oil

2.3大籽蒿精油抗氧化活性

2.3.1大籽蒿精油對DPPH自由基的清除作用

圖3 大籽蒿精油對DPPH自由基的清除能力Fig.3 DPPH scavenging effect of the essential oil

DPPH是一種人工合成的有機(jī)自由基,常用來評估抗氧化物的供氫能力,在有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定[24]。如圖3所示,大籽蒿精油對DPPH自由基具有一定的清除能力,VC和大籽蒿精油清除DPPH自由基的IC50分別為56、43 μg/mL,可見樣品大籽蒿精油對DPPH自由基清除能力總體強(qiáng)于VC;當(dāng)大籽蒿精油質(zhì)量濃度為200 μg/mL時對DPPH自由基清除率達(dá)到86.7%。

2.3.2大籽蒿精油對ABTS+·的清除作用

圖4 大籽蒿精油對ABBTTSS+·的清除能力Fig.4 ABTS+· scavenging effect of the essential oil

ABTS+·是一種呈藍(lán)綠色相對穩(wěn)定的水溶性自由基,抗氧化物與ABTS+·反應(yīng)后使溶液褪色,特征吸光度降低。在該反應(yīng)體系中溶液褪色越明顯則表明所檢測物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)[25]。如圖4所示,大籽蒿精油對ABTS+·的清除作用與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān),當(dāng)大籽蒿精油質(zhì)量濃度為200 μg/mL時清除率達(dá)到82%,高于同質(zhì)量濃度的VC(73%);大籽蒿精油和VC清除ABTS+·的IC50分別為64、43 μg/mL,可見大籽蒿精油對ABTS+·的清除作用要強(qiáng)于VC。

2.3.3大籽蒿精油對羥自由基的清除作用

圖5 大籽蒿精油對羥自由基的清除能力Fig.5 Hydroxyl free radical scavenging effect of the essential oil

從圖5可知,在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi),大籽蒿精油和VC對羥自由基的清除能力均呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系,隨著質(zhì)量濃度的增加清除羥自由基的清除能力增大;VC和大籽蒿精油清除羥自由基的IC50分別為89、51 μg/mL,可見大籽蒿精油對羥自由基的清除效果要明顯強(qiáng)于VC。當(dāng)大籽蒿精油質(zhì)量濃度為200 μg/mL時對羥自由基的清除率達(dá)到了78%,要強(qiáng)于同質(zhì)量濃度的VC。

3 結(jié) 論

本實驗通過GC-MS技術(shù)對西藏地區(qū)所產(chǎn)大籽蒿的精油化學(xué)成分進(jìn)行鑒定分析,大籽蒿精油中主要化學(xué)成分為紅沒藥醇、蘭香油奧、薰衣草醇和α-水芹烯等,其中紅沒藥醇、蘭香油奧兩種組分總含量占精油總量的一半以上,而在本實驗大籽蒿精油中未檢測到側(cè)柏酮、樟腦等有毒成分[14-15,26],可見環(huán)境因素對大籽蒿精油中化學(xué)成分影響很大。現(xiàn)代藥理實驗表明紅沒藥醇具有抗炎、滅菌、愈合潰瘍、溶解膽石等作用,在醫(yī)藥行業(yè)中具有廣泛的的用途[27];蘭香油奧則具有明顯的體內(nèi)抗炎能力[28]。

大籽蒿精油體外抑菌實驗表明:大籽蒿精油對枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌和新型隱球菌均具有較強(qiáng)的抗菌能力,且抑菌效果強(qiáng)于AMP;而供試大籽蒿精油對大腸桿菌的抑菌能力較其他菌較弱。大籽蒿精油體外抗氧化活性實驗表明大籽蒿精油對DPPH自由基、ABTS+·和羥自由基的IC50均低于VC,說明大籽蒿精油具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力,且抗氧化作用要強(qiáng)于VC。

綜上所述可見西藏地區(qū)所產(chǎn)大籽蒿及其精油可以作為一種較為安全的抑菌藥材和天然抗氧化物來源,在食品、飼料、醫(yī)療中具有廣泛的開發(fā)潛力。

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Chemical Composition, Antimicrobial and Antioxidant Activities of the Essential Oil of Artemisia sieversiana

LI Hailiang1, CHEN Haikui2,*, XU Fuli1,3,*, WANG Weiling4, LI Jilin4
(1. College of Natural Resources and Environment, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2. College of Biological Science and Engineering, Beifang University of Nationalities, Yinchuan 750021, China;3. Institute of Soil and Water Conservation, Ministry of Water Resources, Chinese Academy of Sciences, Yangling 712100, China;4. College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil of Artemisia sieversiana, a traditional medicinal herb in Tibet, China, were investigated. A total of 48 components, representing 95.36% of the total oil, were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), with the main constituents being α-bisabolol, chamazulene, α-phellandrene, palmitic acid and lavandulol. The antimicrobial activities of the oil were evaluated against five microorganisms, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus and Crytococcus neofonman, respectively. The results showed that the oil possessed inhibitory activity against B. subtilis, E. faccalis, S. aureus and C. neoformans, amon+g which the best inhibition was observed against C. neoforman with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 5.5 μg/mL. The oil revealed a relatively stronger scavenging effect on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS+·) and hydroxyl free radicals in a concentration-dependent way.

Artemisia sieversiana; essential oil; antioxidant activity; antimicrobial activity

10.7506/spkx1002-6630-201620011

R962

A

1002-6630(2016)20-0063-06

李海亮, 陳海魁, 徐福利, 等. 大籽蒿精油化學(xué)成分及其抗菌抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(20): 63-68.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201620011. http://www.spkx.net.cn

LI Hailiang, CHEN Haikui, XU Fuli, et al. Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil of Artemisia sieversiana[J]. Food Science, 2016, 37(20): 63-68. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201620011. http://www.spkx.net.cn

2016-01-25

國家民委科研項目(14BFZ005);陜西省科技計劃項目(S2014SF4025);河西學(xué)院青年教師基金項目(QN2014-20)

李海亮(1982—),男,博士研究生,研究方向為植物營養(yǎng)學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail:slalihailiang@163.com

陳海魁(1980—),男,講師,博士,研究方向為植物學(xué)。E-mail:haikui2000@hotmail.com

徐福利(1958—),男,研究員,博士,研究方向為植物營養(yǎng)學(xué)和生態(tài)學(xué)。E-mail:xfl@nwsuaf.edu.cn

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