響應面法優化冬蟲夏草菌產多糖液體發酵培養基

邵紫培，趙瑩，袁洪水

（河北農業大學生命科學學院，河北保定071000）

科學實驗研究

響應面法優化冬蟲夏草菌產多糖液體發酵培養基

邵紫培，趙瑩，袁洪水*

（河北農業大學生命科學學院，河北保定071000）

本試驗應用響應面法對冬蟲夏草菌CC-10液體發酵培養基進行優化，以提高胞內多糖含量同時降低生產成本。試驗以多糖含量為響應值，先通過單因素試驗確定最適碳源和氮源，采用Plackett-Burman試驗從7個培養基組分中篩選出主要影響因素，爬坡試驗逼近最佳響應值區域，最終通過Box-Behnken Design和響應面分析確定主因素的最優濃度。結果表明：冬蟲夏草菌CC-10產多糖的最適碳源為麥芽糖，最適氮源為蛋白胨，綜合菌株生長特性和生產成本，選擇葡萄糖、麥芽糖組合碳源和蛋白胨、豆餅粉組合氮源；確定葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨3個主因素，得到最優的產多糖培養基為葡萄糖9.3 g/L、麥芽糖18.8 g/L、蛋白胨6.1 g/L、豆餅粉4 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、核黃素0.5 mg/L。優化后的多糖含量為4.23%，是優化前的2.06倍。試驗為后續大規模發酵生產提供理論參考。

響應面法；冬蟲夏草菌；多糖；培養基優化

冬蟲夏草是由冬蟲夏草菌侵染青藏高原山草甸土中的蝙蝠蛾科昆蟲的幼蟲而形成的蟲草復合體（許亮等，2011）。冬蟲夏草富含多糖、核苷、氨基酸和無機元素等多種活性物質，保健防病作用顯著，但是其生長環境特殊，自然資源匱乏，價格昂貴。研究表明，人工發酵后的冬蟲夏草菌絲體與天然冬蟲夏草成分相似，多糖類、核苷類等藥用成分的含量甚至高于天然冬蟲夏草，且二者具有相同的功效和藥理作用（石巖等，2013；詹小濤等，2012）。邵紫培等（2016）用CC-10冬蟲夏草菌粉飼喂肉雞，結果顯示0.1%或0.2%添加量均能提高肉雞的免疫功能和生長性能。本試驗對CC-10菌株產多糖液體發酵培養基進行優化，期望可以在提高胞內多糖含量的同時降低生產成本，為將來更好地應用于畜牧生產提供理論參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株冬蟲夏草菌CC-10，保藏于河北農業大學生命科學學院制藥工程實驗室。

1.1.2培養基PDA加富培養基。

種子液體培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L，pH值6.7。

基礎發酵培養基：碳源26 g/L、氮源10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、核黃素0.5 mg/L，pH值6.7。

1.2試驗方法

1.2.1培養方法種子液制備：挖取已活化的CC-10菌種1～2 cm2接種于種子培養基中，裝液量為100 mL/500 mL，26℃、180 r/min搖床培養4 d。

發酵液制備：將種子液以10%（V/V）的接種量接種于發酵培養基中，裝液量為100 mL/500 mL，26℃、180 r/min搖床培養5 d。

將發酵液離心，菌絲體60℃烘干至恒重，粉碎，過60目篩，即為檢測樣品。

1.2.2多糖含量測定取冬蟲夏草菌粉，用80%乙醇脫脂，除去單糖和低聚糖，加入適量的超純水，90℃超聲提取4次，1 h/次，濃縮，Sevage法除去蛋白，加入4倍體積95%的乙醇，靜置24 h，離心收集沉淀，用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥，得到冬蟲夏草菌絲體精制多糖（穆文靜等，2011）。標準曲線的繪制參照黎晶晶和徐格非（2008）的方法。

菌絲體多糖含量測定采用苯酚-硫酸法：取0.1 mL樣品多糖溶液置于試管中，補加蒸餾水至體積為1 mL，之后操作同標準曲線制作，將所得吸光度帶入標準曲線得多糖濃度，并計算菌絲體中多糖含量。

1.2.3單因素試驗以菌絲體多糖含量為指標，分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、麥芽糊精為唯一碳源，種子液以7%的接種量接種，26℃、180 r/min搖床培養5 d。以最優碳源為基礎，分別以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、蠶蛹粉、豆餅粉為唯一氮源，以相同發酵條件進行發酵試驗，測定菌絲體多糖含量。

1.2.4Plackett-Burman（PB）試驗設計PB設計是一種近飽和的2水平的試驗設計方法，每個變量選取高（+）、低（-）兩個水平，包括虛擬變量在內共計11個變量，分別為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11，經Design-expert 8.05軟件設計后，會產生12次試驗，最終得到一個多元一次回歸方程。

1.2.5最陡爬坡試驗最陡爬坡試驗的爬坡方向與試驗值變化的梯度方向一致，變化步長由各因素效應值的大小決定，能快速、經濟地逼近最佳值區域（Montgomery等，1991）。

1.2.6Box-Behnken Design（BBD）試驗設計通過進行三因素三水平（-1，0，+1）試驗得到包括一次項、平方項和交互項的多元二次回歸方程。采用Design-expert 8.05軟件繪制響應面立體分析圖，得出響應值的最優值和各因素的最優水平。所得到的參數需進行多次重復試驗，以驗證模型的可靠性，并確定最終的優化結果。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1碳源對菌絲體多糖含量的影響由圖1可知，CC-10菌株能在不同程度上利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，而不能有效利用麥芽糊精產生胞內多糖。其中，以麥芽糖為發酵培養基唯一碳源時，菌絲體多糖含量最高，為（2.36±0.14）%，而以葡萄糖為單一碳源時，多糖含量為（2.00±0.24）%，并且葡萄糖價格較麥芽糖低，所以選擇葡萄糖和麥芽糖作為組合碳源進行后續試驗。

圖1　碳源對多糖含量的影響

2.1.2氮源對菌絲體多糖含量的影響由圖2可知，CC-10菌株能不同程度利用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、蠶蛹粉、豆餅粉，其中，以蛋白胨為唯一氮源時，菌絲體多糖含量最高，可達（2.75± 0.34）%。綜合考慮菌株生長特性和工業化生產成本，選用價格較為低廉的豆餅粉與蛋白胨共同作為后續研究的氮源。

圖2　氮源對多糖含量的影響

表1　Plackett-Burman試驗設計與結果

2.2PB試驗篩選主效應因子結合單因素試驗結果，本研究選取7個潛在的影響CC-10菌絲體多糖含量的因素為實際變量，包括葡萄糖（X1）、麥芽糖（X2）、蛋白胨（X3）、豆餅粉（X4）、MgSO4（X5）、KH2PO4（X6）、核黃素（X7），并余4個虛擬變量X8、X9、X10、X11作為誤差分析來進行PB試驗。PB試驗設計和結果見表1，每個因素包括高低兩個水平，每組試驗3個重復取平均值。

由表2可知，該模型極顯著（P=0.0064＜0.01）。在90%的置信區間內，對胞內多糖含量有顯著影響的因素依次為麥芽糖＞蛋白胨＞葡萄糖，三個因素均表現為負效應，濃度可適當降低，作為發酵優化的主要因素，進行后續響應面分析。其他四種因素對胞內多糖含量影響不顯著，為降低生產成本，應維持在低水平。各因素經回歸分析，得多元一次方程：

表2　Plackett-Burman設計各因素效應分析和評價

經方差分析，該模型Prob＞F值為0.0064，所得回歸方程極顯著，證明該模型在所研究區域擬合良好。決定系數R2為97.08%，調整性決定系數Adj R2為91.98%，進一步證明了該模型的可靠性。精密度顯示的是信噪比，其值大于4.0視為合理，本試驗精密度達14.001。

2.3最陡爬坡試驗為了逼近多糖含量最高的區域，根據PB篩選出的主效應值的大小及正負進行了爬坡試驗。由表3可知，當葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨濃度分別為9、19、6 g/L時，多糖含量達到最高4.17%，表明最高多糖含量區在第4組試驗附近。

表3　最陡爬坡試驗設計及結果

2.4Box-Behnken中心組合試驗結果與分析

2.4.1Box-Behnken中心組合試驗結果根據最陡爬坡試驗結果，選擇第4組作為Box-Behnken中心組合試驗的中心點，利用Design-Expert 8.05軟件設計3因素3水平，共17個試驗點的中心組合試驗，共包括12個析因點和5個零點重復，試驗設計及結果見表4。

利用Design-Expert 8.05軟件對中心組合試驗結果進行響應面分析，得到多糖含量（Y）對葡萄糖（A）、麥芽糖（B）、蛋白胨（C）的多元二次回歸方程：

表4　Box-Behnken試驗設計及結果

回歸方程及模型相關顯著性分析見表5。由表5可見，CC-10菌株產胞內多糖響應面試驗模型Pr=0.0010＜0.01，說明方程擬合度較好，在α= 0.01水平上回歸極顯著；失擬項誤差為0.1288＞0.05，表明失擬不顯著，殘差是由隨機誤差引起，證明該模型選擇較合適；復相關系數R2=0.9492，說明預測值和試驗值之間相關性高度一致；調整性決定系數Adj R2=0.8840，表明該模型可信度很高，可以很好地描述試驗結果。由表5可知，因素A、B、C對產多糖的線性效應均不顯著；因素A2、B2、C2對產多糖的曲面效應均顯著；因素A、C和B、C之間對產多糖的交互影響均不顯著，而因素A、B之間對產多糖的交互影響顯著。

2.4.2CC-10菌株產多糖響應面分析利用Design-Expert 8.05軟件根據多元二次回歸方程繪制了相應的三維響應曲面和等高線圖（圖3～5），用該圖對影響多糖產量的任何兩種因素之間的交互效應進行分析，進而確定最佳因素水平。

表5　響應面試驗方差結果分析

圖3　葡萄糖和麥芽糖對多糖含量交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）

由圖3可知，葡萄糖和麥芽糖對多糖含量的影響顯示，當蛋白胨含量為6 g/L時，多糖含量隨著二者含量的增加先升高后下降，趨勢一致，但是沿葡萄糖方向的等高線密度大于沿麥芽糖方向的等高線密度，說明在一定范圍內增加葡萄糖的量比增加麥芽糖的量更有效。同時可以看出等高線接近橢圓，說明兩者交互作用顯著（P＜0.05）。由圖4可知，葡萄糖和蛋白胨對多糖含量的影響顯示，當麥芽糖含量為19 g/L時，多糖含量隨著二者含量的增加先升高后下降，但是沿蛋白胨方向的等高線密度大于沿葡萄糖方向的等高線密度，說明在一定范圍內增加蛋白胨的量比增加葡萄糖的量更有效。但是等高線不接近橢圓，說明兩者交互作用不顯著（P＞0.05）。由圖5可知，麥芽糖和蛋白胨對多糖含量的影響顯示，當葡萄糖含量為9 g/L時，多糖含量隨著二者含量的增加先升高后下降。但是等高線不接近橢圓，說明兩者交互作用不顯著（P＞0.05）。

圖4　葡萄糖和蛋白胨對多糖含量交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）

圖5　麥芽糖和蛋白胨對多糖含量交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）

2.4.3CC-10菌株產多糖響應面結果的優化分析與條件驗證回歸方程對CC-10菌株產多糖響應面試驗擬合良好，因此可用回歸方程對此試驗結果進行優化分析。采用Design-Expert 8.05軟件獲取多糖含量最大值，步驟如下：Optimization→Numerical→Criteria中選取“多糖含量”，Goal中選擇maximize，設置Upper為6，Lower為默認→Solutions中可得到最大值為4.2318%，此時，葡萄糖含量為9.32 g/L、麥芽糖含量為18.79 g/L、蛋白胨含量為6.14 g/L，實際試驗中添加量為葡萄糖9.3 g/L、麥芽糖18.8 g/L、蛋白胨6.1 g/L。為了驗證多糖含量模型的有效性和實用性，利用最佳發酵培養基進行6次驗證試驗，測得多糖含量的平均值為（4.16±0.15）%，與預測結果基本一致，因此該模型能較好地預測實際發酵情況。優化前多糖含量為2.05%，利用最優發酵培養基發酵胞內多糖含量是未優化的2.06倍。

3　討論

蟲草多糖對免疫系統具有增強作用，具體表現為能促進淋巴細胞的轉化和刺激腹腔吞噬細胞的吞噬功能，進而提高機體免疫力（郎久義等，2008）。胡雅婷等（2004）利用蟲草菌粉飼喂雛雞，結果顯示，中、高劑量（0.6、1.8 g/kg）蟲草菌粉能夠極顯著提高淋巴細胞轉化率。王米等（2015）研究表明，合適濃度的蛹蟲草多糖能促進小鼠腹腔巨噬細胞產生NO、NOS和iNOS以及TNF-α，從而增強巨噬細胞的功能。本研究以冬蟲夏草菌CC-10液體發酵產多糖為優化指標進行響應面試驗，優化后的胞內多糖含量達4.23%，是優化前的2.06倍，可以用于生產更優的飼料添加劑。

培養基的優化常采用正交試驗法和響應面法，正交試驗法可同時考慮多個因素并且尋找最佳因素水平組合，但是無法得到因素與響應值在整個區域的一個明確回歸方程，因而無法得到最佳組合和響應值的最優值。響應面法可用來確定試驗因素及因素間的交互作用對試驗過程中響應值的影響，通過回歸方程及三維曲面圖能準確、清晰地得出最優試驗因素及響應值，因此應用廣泛。陳雄等（2009）利用響應面法優化地衣芽孢桿菌A2發酵培養基，優化后發酵液中A2的活菌含量達1.30×1011cfu/mL，比優化前提高了近3倍。王飛等（2007）采用響應面法優化北蟲草產多糖液體發酵培養基，優化后培養液多糖含量為1.977×10-2g/mL。本試驗先采用單因素試驗確定了最佳碳源、氮源的種類，進而利用響應面法優化CC-10菌株產多糖液體發酵培養基，優化后胞內多糖含量為4.23%。

4　結論

本試驗采用響應面法優化冬蟲夏草菌CC-10產多糖液體發酵培養基，經響應面分析確定了最優培養基為葡萄糖9.3 g/L、麥芽糖18.8 g/L、蛋白胨6.1 g/L，通過多元二次回歸方程分析，該模型回歸顯著，擬合度良好，為后續大規模發酵生產提供了理論參考。

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In order to enhance cell yield of polysaccharide and reduce production cost，this study used response surface methodology to optimize liquid fermentation medium of Cordyceps sinensis CC-10 strain.Taking the content of polysaccharide as response value，the single-factor design was used to screen the suitable carbon and nitrogen source. Plackett-Burman design was employed to screen main influence factors from seven medium components.Then the steepest ascent experiment was used to approach maximum response area.Last optimum levels of critical variables were determined by Box-Behnken Design.The results showed that maltose and peptone were screened as the optimal carbon source and nitrogen source，respectively.Considering the growth characteristics of CC-10 strain and production cost，combination carbon source of glucose and maltose，combination nitrogen source of peptone and bean cake powder were chose.Glucose，maltose and nitrogen were identified as main influencing factors，the optimized composition were：glucose 9.3 g/L，maltose 18.8 g/ L，peptone 6.1 g/L，bean cake powder 4 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，riboflavin 0.5 mg/L.Under the optimum medium，cell yield of polysaccharide was up to 4.23%，which was increased by 1.06 times of previous optimization.The study could provide a theory reference for the mass production in the future.

response surface methodology；Cordyceps sinensis；polysaccharide；medium optimization

S816.7

A

1004-3314（2016）13-0009-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161302