復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的工藝優(yōu)化

王廣慧

（黑龍江省綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

檢測(cè)分析

復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的工藝優(yōu)化

王廣慧

（黑龍江省綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

為研究復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的最適條件，本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)固液比、酶反應(yīng)時(shí)間、酶反應(yīng)溫度、酶反應(yīng)pH、高壓時(shí)間及高壓溫度對(duì)黃酮得率的影響進(jìn)行了研究，并以金針菇黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的最優(yōu)條件是：固液比為1∶35（g/mL），酶反應(yīng)時(shí)間為80 min，酶反應(yīng)溫度為50℃，酶反應(yīng)pH為6，高壓處理溫度為115℃，高壓處理時(shí)間為40 min。以上述條件從金針菇中提取黃酮，得率可達(dá)13.45%。

金針菇；黃酮；復(fù)合酶；高壓；提取

金針菇［Flammulinavelutiper（Fr.）Sing］中富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中的黃酮類化合物具有消除疲勞、保護(hù)心腦血管、預(yù)防動(dòng)脈硬化、疏通微循環(huán)、抗衰老以及活化大腦和其他臟器細(xì)胞的功效，且毒副作用很小（侯波等，2013；方玉梅等，2012a、b），既可作為保健食品，也可開(kāi)發(fā)為動(dòng)物飼料添加劑。目前關(guān)于金針菇黃酮提取工藝研究的報(bào)道很多，但普遍存在提取率低的缺點(diǎn)。本試驗(yàn)采用復(fù)合酶輔助高壓法從金針菇中提取黃酮，其中的高壓提取技術(shù)是本課題組研發(fā)出來(lái)的有效提取食用菌中生物活性物質(zhì)的方法，目前已成功用于黑木耳多糖、香菇多糖及金針菇中總黃酮的提取（王廣慧等，2015、2013）。復(fù)合酶輔助高壓法集復(fù)合酶提取法和高壓提取法的優(yōu)點(diǎn)于一體，為開(kāi)發(fā)金針菇黃酮提供了重要參考。

1　材料與儀器

1.1材料與試劑金針菇由綏化學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)所得；木瓜蛋白酶和纖維素酶購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；試驗(yàn)所用硝酸鋁、亞硝酸鈉等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器TDL-5A型離心機(jī)：金壇市新航儀器廠；JK-G-500B2型高速粉碎機(jī)：上海精科儀器公司；752型分光光度計(jì)：上海光學(xué)儀器廠；BL-50A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋：上海衡平儀器儀表廠。

2　方法

2.1檢測(cè)方法線性回歸方程的獲取：以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，先加入5%的NaNO2溶液，再加入10%的Al（NO3）3溶液，最后加入4%的NaOH溶液（王廣慧等，2015）。在堿性條件下，黃酮類物質(zhì)可與鋁鹽相絡(luò)合。此絡(luò)合物在510 nm處表現(xiàn)出特征性的光吸收峰，其吸光值與黃酮的濃度呈正相關(guān)。

2.2復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的具體操作方法將金針菇中的雜質(zhì)清除干凈，置于50℃烘箱中干燥至恒重，用高速粉碎機(jī)將其制成干粉并過(guò)80目篩。稱取每份為3.0 g的金針菇粉若干份，放于燒杯中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和復(fù)合酶（木瓜蛋白酶和纖維素酶按質(zhì)量比1∶1混合），在恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解反應(yīng)，然后置于立式壓力蒸汽滅菌器中浸提。將提取液離心后所獲上清蒸發(fā)濃縮后用3倍體積的95%乙醇于4℃冰箱中沉淀過(guò)夜。沉淀中的多糖等雜質(zhì)可通過(guò)離心清除。按照2.1法測(cè)出提取液中黃酮含量并計(jì)算出黃酮得率。重復(fù)3次。

2.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

2.3.1單因素試驗(yàn)方案

2.3.1.1固液比影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別在5份金針菇粉中加入樣品量1.00%的復(fù)合酶，并按照固液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）加入pH=5的緩沖液，在50℃下酶解80 min后再在108℃下高壓提取40 min。

2.3.1.2酶反應(yīng)時(shí)間影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)在最佳固液比、酶添加量為1.00%、酶解溫度為50℃，反應(yīng)pH為5的條件下，設(shè)定酶反應(yīng)時(shí)間分別為50、60、70、80n、90 min，然后在108℃下高壓熱水浸提40 min，提取后測(cè)定黃酮得率。

2.3.1.3酶反應(yīng)溫度影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)在最佳固液比、最佳酶反應(yīng)時(shí)間、酶添加量為1.00%、反應(yīng)pH為5的條件下，分別設(shè)置酶反應(yīng)溫度為30、40、50、60、70℃，然后在108℃下高壓熱水浸提40 min，提取后測(cè)定黃酮得率。

2.3.1.4酶反應(yīng)pH影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)在固液比、酶反應(yīng)時(shí)間及酶反應(yīng)溫度都取最佳值，酶添加量為1.00%的條件下，調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)pH，分別設(shè)為3、4、5、6、7，然后在108℃下高壓熱水浸提40 min，提取后測(cè)定黃酮得率。

2.3.1.5高壓溫度影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)在上述四個(gè)影響因素都處于最佳值的情況下，將金針菇粉的高壓浸提溫度分別設(shè)為75、90、108、115、121℃，高壓處理時(shí)間設(shè)為40 min，提取后測(cè)定黃酮得率。

2.3.1.6高壓時(shí)間影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)在以上影響因素都取最佳值的條件下，將金針菇粉分別按照高壓時(shí)間30、40、50、60、70 min進(jìn)行處理并測(cè)定黃酮得率。

2.3.2正交試驗(yàn)方案基于單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)，選取對(duì)金針菇黃酮得率影響較大的因素和水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以優(yōu)化出提取金針菇黃酮的最適條件。

3　結(jié)果與分析

3.1線性回歸方程的獲取按照2.1所述方法進(jìn)行試驗(yàn)操作，得到線性回歸方程為：y=0.3759x+ 0.0196，R2=0.9979，式中：y為光吸收值，x為蘆丁（黃酮）含量，mg/mL。

3.2復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1.1固液比影響的試驗(yàn)結(jié)果由圖1可知，黃酮得率在固液比為1∶35（g/mL）時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，為11.78%，可見(jiàn)太高或太低的固液比都不宜于黃酮的溶出，而且過(guò)高的固液比還會(huì)增加后續(xù)濃縮試驗(yàn)的難度，所以選擇1∶35為金針菇黃酮提取的最佳固液比。

圖1　固液比對(duì)金針菇黃酮得率的影響

3.2.1.2酶反應(yīng)時(shí)間影響的試驗(yàn)結(jié)果在最佳固液比為1∶35（g/mL）的條件下，改變酶反應(yīng)時(shí)間，得到的黃酮得率數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)金針菇黃酮得率的影響

由圖2可知，80 min酶反應(yīng)時(shí)間時(shí)金針菇黃酮的得率最高，為11.78%，因此最佳酶反應(yīng)時(shí)間是80 min。分析其原因可能是酶反應(yīng)時(shí)間太短時(shí)酶解不徹底，而酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)使酶變性失活，所以兩種情況下都不利于金針菇細(xì)胞中黃酮物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致黃酮得率降低。

3.2.1.3酶反應(yīng)溫度影響的試驗(yàn)結(jié)果按照最佳料液比1∶35加緩沖液、酶解時(shí)間為80 min，在此條件下，改變酶反應(yīng)溫度，所得黃酮得率如圖3所示。

圖3　酶反應(yīng)溫度對(duì)金針菇黃酮得率的影響

由圖3可知，酶反應(yīng)溫度在50℃時(shí)金針菇黃酮的得率最高，為11.78%，因此最佳酶反應(yīng)溫度是50℃。分析原因可能是，溫度過(guò)低時(shí)酶活也低，而溫度過(guò)高又會(huì)導(dǎo)致酶變性失活。

3.2.1.4酶反應(yīng)pH影響的試驗(yàn)結(jié)果在固液比、酶反應(yīng)時(shí)間及酶反應(yīng)溫度都取最佳值的條件下，調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)pH，所得黃酮得率如圖4所示。

圖4　酶反應(yīng)pH對(duì)金針菇黃酮得率的影響

由圖4可知，pH為6的反應(yīng)條件下可得到12.91%的黃酮得率，為最高，因此最佳酶反應(yīng)pH為6。分析原因可能是pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響到酶和底物可解離基團(tuán)的解離，從而影響到酶促反應(yīng)的速率。

3.2.1.5高壓溫度影響的試驗(yàn)結(jié)果在上述四個(gè)影響因素都取最佳值的情況下，改變高壓熱水浸提溫度，所得黃酮得率如圖5所示。

圖5　高壓浸提溫度對(duì)金針菇黃酮得率的影響

由圖5可知，高壓處理溫度為115℃時(shí)黃酮得率最高，為13.45%。分析其原因可能是高壓浸提溫度過(guò)低時(shí)金針菇細(xì)胞沒(méi)有完全被解體，黃酮類物質(zhì)不能與溶媒充分接觸而不利于其釋放，而高壓浸提溫度過(guò)高則會(huì)破壞活性黃酮的分子結(jié)構(gòu)，從而降低其得率。

3.2.1.6高壓時(shí)間影響的試驗(yàn)結(jié)果在以上影響因素都取最佳值的條件下，改變高壓浸提時(shí)間，得到的數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　高壓浸提時(shí)間對(duì)金針菇黃酮得率的影響

由圖6可知，高壓浸提時(shí)間為40 min時(shí)黃酮的得率13.45%為最高，因此選擇40 min為最適的高壓處理時(shí)間。分析原因可能是高壓時(shí)間太短會(huì)導(dǎo)致金針菇細(xì)胞不能完全被破壞，從而使黃酮類物質(zhì)釋放不完全，而高壓時(shí)間太長(zhǎng)則會(huì)破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，降低活性黃酮的得率。

3.2.2正交試驗(yàn)結(jié)果基于單因素試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1，其中固液比固定為1∶35（g/mL），酶添加量固定為1.00%，酶反應(yīng)時(shí)間固定為80 min。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，各因素對(duì)黃酮得率的影響大小順序依次為A（酶反應(yīng)溫度）＞C（高壓溫度）＞B（酶反應(yīng)pH）＞D（高壓時(shí)間），由此確定提取金針菇黃酮的最優(yōu)條件為A2C2B2D2，即：酶反應(yīng)溫度為50℃，高壓處理溫度為115℃，酶反應(yīng)pH為6，高壓處理時(shí)間為40 min。在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，得到金針菇總黃酮得率為13.45%。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。研究結(jié)果顯示，此法對(duì)金針菇黃酮的提取效果較好，得率較高。分析其原因可能是：一方面，通過(guò)復(fù)合酶的酶解過(guò)程強(qiáng)化了傳質(zhì)過(guò)程，增加了黃酮的得率（王蕓蕓等，2008）；另一方面，高溫高壓作用能使細(xì)胞解體，使被提取物質(zhì)充分溶出（王廣慧等，2015）。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的最適條件是：固液比為1∶35（g/mL），酶反應(yīng)時(shí)間為80 min，酶反應(yīng)溫度為50℃，酶反應(yīng)pH為6，高壓處理溫度為115℃，高壓處理時(shí)間為40 min。以上述條件從金針菇中提取黃酮，得率可達(dá)13.45%。

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In this study，a composite enzyme assisted with high pressure extraction method was developed for the extraction of flavonoids from Flammulina velutiper.The extraction conditions were optimized through the single factor and orthogonal tests.The effects of solid-liquid ratio，enzymatic reaction time，enzymatic reaction temperature，enzymatic reaction pH，high-pressure extraction time and high-pressure extraction temperature on the extraction yield of flavonoids were investigated.The experimental results showed that the optimal condition was solid-liquid ratio of 1∶35（g/mL），enzymatic reaction time of 80 min，enzymatic reaction temperature of 50℃，enzymatic reaction pH of 6，high-pressure extraction temperature of 115℃and hig-pressure extraction time of 40 min.Under these conditions，the extraction yield of flavonoids from Flammulina velutipe was up to 13.45%.

Flammulina velutiper（Fr.）Sing；flavonoids；composite enzyme；high-pressure；extraction

水產(chǎn)養(yǎng)殖

S816.7

A

1004-3314（2016）13-0025-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161306

國(guó)家自然科學(xué)基金（21201128）；綏化學(xué)院科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目