Ⅱ型大麻受體激動劑JWH133對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的神經保護作用

唐中華，王強，封海濤，李晶

（1.四川省樂山市博愛醫院，四川樂山614000；2.重慶三峽中心醫院，重慶404000）

Ⅱ型大麻受體激動劑JWH133對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的神經保護作用

唐中華1，王強2，封海濤2，李晶2

（1.四川省樂山市博愛醫院，四川樂山614000；2.重慶三峽中心醫院，重慶404000）

目的探討Ⅱ型大麻受體（CB2）激動劑JWH133預處理對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷后作用的機制。方法將健康成年雄性SD大鼠40只隨機分為假手術組、腦缺血-再灌注模型組（模型組）、JWH133給藥組和溶劑對照組。用改良Zea Longa線栓法建模。Longa評分法評價神經功能，TTC染色法測定缺血側腦組織及周圍血清中白細胞介素（IL）-6和IL-1 水平，TUNEL免疫熒光染色檢測大鼠神經元凋亡情況。結果4組試驗大鼠均不同程度出現神經行為功能異常，但JWH133給藥組大鼠的神經行為功能恢復明顯優于其他3組（P＜0.05）。腦切片染色顯示，3個手術組大鼠均出現供血區白色梗死灶，但JWH133給藥組白色梗死灶較模型組和溶劑對照組縮小（P＜0.05）。模型組大鼠腦組織及血清中IL-6、IL-1 水平較假手術組顯著升高，JWH133給藥組治療后2種炎性因子水平均有不同程度降低，與溶劑對照組對比均有顯著性差異（P＜0.05）。TUNEL染色顯示，假手術組幾乎無凋亡細胞，模型組及溶劑對照組凋亡細胞數量顯著增加，JWH133給藥組凋亡神經細胞顯著減少。結論JWH133預處理通過抑制腦缺血-再灌注損傷過程發揮神經保護作用，其機制可能與降低IL-6、IL-1 水平及發揮抗凋亡作用有關，尚待進一步探討。

Ⅱ型大麻受體激動劑；JWH133；腦缺血-再灌注；神經保護作用

大麻是最早被人類認識和使用的藥物之一，具有止痛、鎮靜、抗痙攣、抗嘔吐、抗青光眼，以及抗高血壓等多種藥理作用［1］。大麻系統已知有Ⅰ型大麻受體（CB1）和Ⅱ型大麻受體（CB2）2種亞型，均屬于典型G蛋白偶聯受體（GPCR），具有7次跨膜蛋白結構域［2］。CB2主要存在于外周免疫系統，激活后具有顯著抗炎作用［3-4］。有研究發現，腦神經膠質細胞中也有CB2受體表達且對腦神經元具有保護作用［5-6］。隨后，JWH133等一系列CB2激動劑陸續被開發出來。缺血性腦損傷目前是威脅人類的第三大致死和致殘病因，大鼠大腦中動脈閉塞模型是研究人類腦卒中、模擬人腦缺血性損傷的經典模型。本試驗中擬采用大鼠局灶性腦動脈缺血-再灌注損傷模型，觀察CB2激動劑JWH133對腦組織梗死范圍和血清中白細胞介素（IL）-6、IL-1β水平的影響，通過檢測大鼠神經元凋亡情況，論證CB2激動劑對腦缺血-再灌注損傷神經的保護作用。

1　資料與方法

1.1動物與試藥

1.1.1動物

雄性SD大鼠40只，清潔級，體重250～280 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK（渝）2009-0001。

1.1.2試藥

JWH133（美國Sigma公司，使用時先用二甲基亞砜配成母液，再用生理鹽水稀釋成濃度為3.0×10-3mol/L的溶液）；IL-6和IL-1β定量酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，濟南鴻鑫化工有限公司）；TUNEL試劑盒（德國Roche公司）；Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3抗體均購自英國Abcam公司；β-actin抗體（Santa Cruz公司）；氯代三苯基四氮唑（TTC，上海化學試劑廠）；其余試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1模型建立

采用改良Zea-Longa［4］法制備局灶性腦缺血模型（MCAO）：大鼠腹腔注射4.5%水合氯醛（0.1 mL/kg）麻醉，仰臥位固定，正中切口，鈍性分離皮下肌肉組織，暴露右側的血管和神經。分離右頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈。結扎頸總動脈和頸外動脈根部，在頸總動脈近分叉處剪一小口，插入自制線栓至頸內動脈18～22 mm，扎緊并固定插線，縫合皮膚，阻斷血流2 h后輕輕拔線，恢復缺血半腦血流以實現再灌注，24 h后斷頭取腦。假手術組不插線栓，步驟同其他組。大鼠醒后出現左側肢體癱瘓，站立不穩，提尾向一側轉圈為建模成功。

1.2.2分組及給藥

試驗動物隨機分為假手術組、腦缺血-再灌注模型組（模型組）、JWH133給藥組、溶劑對照組，各10只。JWH133給藥組予JWH133 3.0 mg/kg手術前30 min腹腔給藥，假手術組和腦缺血-再灌注模型組均腹腔注射等量的生理鹽水；溶劑對照組大鼠腹腔注射0.1 mol/L DMSO。

1.2.3神經功能缺損評分

大鼠清醒后1～2 h采用Longa等的5分制標準評分法（5級4分法）［5］評價神經功能缺損情況。1級（0分）：無神經缺損癥狀；2級（1分）：不能伸展對側前爪；3級（2分）：行走時向偏癱側轉圈；4級（3分）：向偏癱側傾倒；5級（4分）：不能自發行走，意識喪失。2～4級（1～3分）為成功模型，計入試驗動物數，將造模成功大鼠用于試驗。

1.2.4TTC染色計算梗死體積

腦缺血-再灌注后24 h，快速取腦組織，置-20℃冰箱暫時冷凍，30 min后置冰盤上操作。腦半球去除嗅球后，由前向后進行冠狀切片，從額極向后間隔2 mm切成5片，2%TTC溶液、37℃避光水浴30 min。用4%的多聚甲醛固定，24 h后拍照。將染色結果錄入軟件并分別計算各腦片缺血側總體積與梗死區域體積，計算梗死區域占大腦半球總體積的百分比。TTC染色由各組隨機取1只大鼠進行腦組織切片。

1.2.5樣品制備

大鼠腦缺血-再灌注24 h后眥內取血，用加有肝素的抗凝離心管收集，4℃下，以3 000 r/min的速率離心10 min，取上清液待測。將取血后的大鼠斷頭取腦，置冰面進行后續操作?？焖偃∮覀却竽X半球額頂葉皮層組織，冷生理鹽水沖洗后再用濾紙盡量吸干殘留水分，稱取腦組織600 mg，加入生理鹽水5.4 mL，制備成10%組織勻漿液，離心條件同上。收集上清液，置-20℃保存。

1.2.6腦組織及血清中IL-6和IL-1β水平測定

采用雙抗體“夾心”ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7TUNEL染色

取大鼠缺血半球部分組織制作成切片，將切片進行常規石蠟包埋處理，將取得的大鼠大腦置二甲苯10 min后，置入梯度乙醇洗5 min；10%甲醛溶液固定，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌5 min×3次。加20%正常牛血清室溫放置30 min，將TUNEL反應混合液加在切片上，37℃溫育90 min，PBS液洗5 min×3次，3%過氧化氫甲醇液室溫阻斷10 min，37℃溫育90 min加POD轉化劑，37℃溫育30 min。PBS液洗3次后顯色，蘇木素淡染，常規脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，在染色陽性半球內隨機選取3個不同視野拍照，通過200倍顯微鏡對每個視野內神經元計數，統計每張切片3個不同視野平均值，對比并分析4組每張切片神經元數量的差異。

1.3統計學處理

2　結果

2.1大鼠神經功能缺損評分

假手術組未出現神經功能缺損癥狀，模型組與溶劑對照組大鼠均不同程度出現神經功能缺損，JWH133給藥組大鼠神經功能缺損程度明顯低于前兩組（P＜0.05）。詳見表1。

表1　JWH133對腦缺血-再灌注大鼠神經功能行為學評分及腦梗死面積的影響（±s，n=10）

表1　JWH133對腦缺血-再灌注大鼠神經功能行為學評分及腦梗死面積的影響（±s，n=10）

注：與假手術組比較， P＜0.05；與溶劑對照組比較，#P＜0.05。表2同。

組別假手術組模型組溶劑對照組J W H 1 3 3給藥組神經功能行為學評分（分）0 ± 0 2 . 4 0 ± 0 . 8 7 2 . 3 0 ± 0 . 6 8 0 . 8 5 ± 0 . 7 3#腦梗死面積（%）0 ± 0 1 3 . 6 4 ± 0 . 8 1 1 2 . 9 8 ± 0 . 9 2 8 . 5 9 ± 0 . 6 7#

2.2對腦缺血-再灌注大鼠腦梗死體積的影響

經TTC染色可見假手術組腦片全部染紅；模型組及溶劑對照組大鼠右側額葉、頂葉皮質及紋狀體出現明顯的白色梗死灶；JWH133給藥組腦缺血-再灌注大鼠的腦梗死體積較前兩組明顯減?。≒＜0.01），見圖1。腦梗死面積計算結果見表1。

圖1　4組大鼠腦切片梗死情況（TTC染色）

2.3腦組織和血清中IL-6及IL-1 水平變化

與假手術組比較，模型組及溶劑對照組缺血側腦組織和血清中IL-6及IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與上述兩組比較，CB2激動劑JWH133給藥組腦組織和血清IL-6及IL-1β水平顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.4對大鼠局灶性神經元凋亡的影響

通過TUNEL染色可檢驗局灶性腦損傷后神經元凋亡的改變，TUNEL染色陽性直觀反映細胞凋亡水平。結果發現，假手術組幾乎無染色陽性細胞，其余3組均凋亡明顯；模型組及溶劑對照組TUNEL染色陽性細胞數明顯多于JWH133給藥組（P＜0.05，見圖2），CB2激動劑JWH133給藥組神經元的凋亡數量下降。

圖2　4組大鼠TUNEL染色神經元凋亡情況（TUNEL染色）

3　討論

大鼠MCAO模型的病理生理變化與腦卒中患者的臨床過程非常相似，這一疾病發生過程中神經元損傷機制非常復雜，包括炎性反應、氧化應激和線粒體功能紊亂導致的細胞凋亡等多方面原因。腦缺血早期首要標志性現象是在缺血病灶中央發生神經元細胞凋亡，隨著病情的發生與發展，缺血半暗帶細胞凋亡數量增多，凋亡細胞散在出現于視前區和紋狀體，然后擴展到大腦皮層。隨著缺血時間的增加，組織損傷程度越來越嚴重，凋亡細胞的數量越來愈多。此外，大量的試驗證據表明，炎性損傷對腦缺血-再灌注的發生與發展起至關重要的作用，缺血區IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平明顯升高。

表2　MCAO模型大鼠腦組織和血清的IL-6、IL-1 水平變化比較（±s，n=10）

表2　MCAO模型大鼠腦組織和血清的IL-6、IL-1 水平變化比較（±s，n=10）

組別假手術組模型組溶劑對照組J W H 1 3 3給藥組腦組織I L -1 （n g / m g）1 1 . 5 2 ± 0 . 9 3 1 3 . 8 4 ± 1 . 1 6 1 3 . 9 1 ± 1 . 2 8 1 1 . 9 2 ± 0 . 9 6#血清I L -1 （n g / m L）2 . 7 5 ± 0 . 3 0 3 . 3 6 ± 0 . 4 1 3 . 6 8 ± 0 . 3 2 3 . 0 7 ± 0 . 3 8#腦組織I L -6（n g / m g）3 . 0 8 ± 0 . 3 7 5 . 3 5 ± 0 . 5 2 5 . 6 5 ± 0 . 5 6 3 . 4 6 ± 0 . 3 1#血清I L -6（n g / m L）1 . 8 5 ± 0 . 2 1 3 . 7 5 ± 0 . 4 7 3 . 2 8 ± 0 . 3 5 2 . 2 8 ± 0 . 2 4#

JWH133屬選擇性CB2激動劑，腦缺血-再灌注損傷后缺血區域CB2表達量逐漸升高［7-8］，激活缺血區域CB2受體發揮其抗炎作用，可減輕缺血性腦損傷，產生神經保護作用。Rodríguez-Arias等［8］最早研究了外源性大麻配體激活CB2產生抗炎和減輕興奮性毒性作用，腦部CB2主要來源于星形膠質細胞，非選擇性大麻素激動劑在體內和體外試驗均有效抑制了α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸（AMPA）誘導的細胞損傷發揮抗炎作用，這一保護作用有刺于CB2的激活。研究發現，腦缺血最開始3 h內，缺血區域mRNA表達下降，隨后其濃度顯著升高，其間花生四烯酸乙醇胺（AEA）大量釋放，激活CB2減輕炎性反應，減少促炎因子的釋放，這一過程可能意味著大鼠腦部大麻系統產生了一定的神經保護作用［9］。

在前期的研究基礎上［10-13］，本試驗進一步研究發現，CB2激動劑JWH133可顯著改善術后大鼠神經功能癥狀，抑制IL-1β和IL-6上調，這一變化可阻斷中性粒細胞激活，從而降低腦缺血-再灌注后中性粒細胞在腦組織中的浸潤和聚集，抑制局部腦組織炎性反應，保護缺血腦組織，這一結果與國外類似研究結果一致［14-15］。

本研究中還發現，陽性細胞主要集中在梗死灶周邊半暗帶區，缺血中心區僅見少量陽性細胞。缺血半暗帶區出現TUNEL陽性細胞，提示細胞凋亡異常增加是推動缺血性腦損傷病情發生與發展的重要因素。JWH133給藥組切片的陽性細胞顯著少于溶劑對照組，這也反映了CB2激動劑對缺血區域細胞具有一定抗凋亡作用。

綜上所述，本試驗中通過建立大鼠腦缺血-再灌注模型，證實大麻CB2激動劑JWH133可減輕大鼠神經功能損傷，縮小梗死面積，抑制腦炎性因子生成，抗腦細胞元發生凋亡，產生顯著神經保護作用。推斷這一機制與JWH133通過降低IL-6及IL-1β水平發揮抗炎作用，減輕缺血性腦損傷或JWH133影響受損區域及其周邊細胞凋亡發揮神經元保護作用有關，但其實現過程尚需進一步探究。

大麻系統的研究方興未艾，在多發性硬化、帕金森綜合征和阿爾茨海默病等神經系統疾病方面具有很大潛力，本研究進一步佐證了其用于治療神經系統疾病具有美好前景［16］。

［1］White BC，Sullivan JM，DeGracia DJ，et al.Brain ischemia and reperfusion：molecular mechanisms of neuronal injury［J］.Journal of the Neurological Sciences，2000，179：1-33.

［2］Zausinger S，Hungerhuber E，Baethmann A，et al.Neurological impairment in rats after transient middle cerebral artery occlusion：a comparative study under various treatment paradigms［J］.Brain Res，2010，863：94-105.

［3］van der Stelt M，Di Marzo V.Cannabinoid receptors and their role in neuroprotection［J］.Neuromolecular Medicine，2005，7（1-2）：37-50.

［4］Sophocleous A，Marino S，Logan JG，et al.Bone cell-autonomous contribution of type 2 cannabinoid receptor to breast cancer-induced osteolysis［J］.Biol Chem，2015，290（36）：22 049-22 060.

［5］Fujii M，Sherchan P，Soejima Y，et al.Cannabinoid receptor type 2 agonist attenuates acute neurogenic pulmonary edema by preventing neutrophil migration after subarachnoid hemorrhage in rats［J］. Acta Neurochir Suppl，2016，121：135-139.

［6］Zhang L，Kolaj M，Renaud LP.Intracellular postsynaptic cannabinoid receptors link thyrotropin-releasing hormone receptors to TRPC-like channels in thalamic paraventricular nucleus neurons［J］. Neuroscience，2015（311）：81-91.

［7］Zhang HY，Gao M，Liu QR，et al.Cannabinoid CB2 receptors modulate midbrain dopamine neuronal activity and dopamine-related behavior in mice［J］.Proceedings of the National Academy of SciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2014，111（46）：5007-5015.

［8］Rodríguez-Arias M，Navarrete F，Blanco-Gandia MC，et al. Role of CB2 receptors in social and aggressive behavior in male mice［J］.Psychopharmacology（Berl），2015，232（16）：3019-3031.

［9］Underdown NJ，Hiley CR，Ford WR.Anandamide reduces infarct size in rat isolated hearts subjected to ischaemia-reperfusion by a novel cannabinoid mechanism［J］.Br J Pharmacol，2012，146（6）：809-816.

［10］封玉玲，陳杰，封海濤.腦脊液中花生四烯酸乙醇胺濃度變化與精神分裂癥的病理機制［J］.中國醫院藥學雜志，2014，34（1）：8-11.

［11］封玉玲，李晶，龍明.CB1拮抗劑利莫那班聯合CB2激動劑JWH133對腦缺血再灌注病理損傷保護作用的研究［J］.中國現代醫學雜志，2015，25（10）：15-18.

［12］李晶，董志，樂樂樂.腦缺血/再灌注對大鼠腦內花生四烯酸乙醇胺濃度的影響及其機理初步研究［J］.激光雜志，2010，31（3）：93.

［13］Zheng L，Wu X，Dong X，et al.Effects of chronic alcohol exposure on the modulation of ishemia-induced glutamate release via cannabinoid receptors in the dorsal hippocampus［J］. Alcohol Clin Exp Res 2015，39（10）：1 908-1 916.

［14］Correa F，Mestre L，Guaza C.Activation of cannabinoid CB2 receptor negatively regulates IL-12 p40 production in murine macrophages：role of IL-10 and ERK1/2 kinase signaling［J］. Br J Pharmacol，2015，145（4）：441-448.

［15］Correa F，Hernangómez M，Mestre L，et al.Anandamide enhances IL-10 production in activated microglia by targeting CB（2）receptors：roles of ERK1/2，JNK，and NF-kappaB［J］.Glia，2010，58（2）：135-147.

［16］Mehta SL，Manhas N，Raghubir R.Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics［J］.Brain Res Rev，2012，54：34-66.

Protective Effect of CB2 Agonist JWH133 on Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

Tang Zhonghua1，Wang Qiang2，Feng Haitao2，Li Jing2
（1.LeshanFraternity Hospital，Leshan，Sichuan，China614000；2.Chongqing Three Gorges Central Hospital，Chongqing，China404000）

ObjectiveTo investigate the effect of CB2 agonist JWH133 pretreatment on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats and its underlying mechanism.Methods40 healthy adult male SD rats were randomly divided into 4 groups（n=10）：sham operation group，model group，JWH133 group and solvent control group.The modified ZeaLonga suture method was used to build the models with，theLonga score was used to evaluate the neurological function，the TTC staining methodwas used to determine the content of ischemic brain tissue and peripheral serum IL-6 and IL-1β，and the TUNEL immunofluorescence stain method was used to detect the apoptosis of rat neurons.ResultsThe rats in the four groups all had different degrees of abnormal neurological function.The JWH133 group was significantly better in the neurological recovery than the other 3 groups（P＜0.05）.Brain slice staining showed that all groups had white perforating artery infarct，but the infarctin the JWH133 group was smaller than the model group and control group（P＜0.05）.The levels of IL-6 and IL-1β in serum and brain tissue of rats in the model group were significantly higher than the sham operation group（P＜0.05），and the two inflammatory factors were reduced after treatment of JWH133（P＜0.05）.TUNEL staining showed that there were almost no apoptotic cells in the sham operation group，the number of model group and solvent control group apoptoticcellswassignificantlyincreased，andtheapoptoticneuronsinJWH133interventiongroupweresignificantlydecreased.ConclusionJWH133 preconditioning may play a neuroprotective role in cerebral ischemia-reperfusion injury，and its mechanism may be related to reducing the levels of IL-6，IL-1β，and playing the role of antiapoptosis.The mechanism of the neuroprotective effect of CB2 agonist JWH133 remains to be further explored.

CB2 agonist；JWH133；cerebral ischemia-reperfusion；neuroprotective effect

R965；R971

A

1006-4931（2016）18-0021-04

重慶市基礎與前沿研究計劃項目，項目編號：cstc2014jcyjA10049；第二批重慶市高等學校青年骨干教師資助計劃項目（2014）；重慶市社會民生科技創新專項，項目編號：cstc2016shmszx130028。

唐中華（1967-），男，碩士研究生，副主任醫師，主要從事神經內科學研究工作，（電子信箱）529433511@qq.com；李晶（1979-），男，博士研究生，副教授，主要從事神經藥理學研究工作，（電話）023-58103788（電子信箱）mybestdorthy@hotmail.com。

（2016-05-13；

2016-06-22）