HPV16E7靶向小干擾RNA對SiHa細胞增殖凋亡及6種抑癌基因的影響

龍嘉 李黎明 許翠 楊佳 蔣明軍

518035深圳大學第一附屬醫院 深圳市第二人民醫院皮膚科（龍嘉）；中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所 江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室（李黎明、許翠、楊佳、蔣明軍）

HPV16E7靶向小干擾RNA對SiHa細胞增殖凋亡及6種抑癌基因的影響

龍嘉 李黎明 許翠 楊佳 蔣明軍

518035深圳大學第一附屬醫院 深圳市第二人民醫院皮膚科（龍嘉）；中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所 江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室（李黎明、許翠、楊佳、蔣明軍）

目的探討HPV16E7在SiHa細胞株中對抑癌基因（MT1G、NMES1、RRAD、SFRP1、SPARC、TFPI2）的表達及細胞增殖能力和凋亡水平的影響。方法SiHa細胞轉染E7SiRNA 48 h后，qPCR檢測E7及6種抑癌基因mRNA水平變化，CCK?8檢測細胞增殖能力改變，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。結果SiHa細胞轉染后48 h，qPCR結果顯示實驗組E7 mRNA顯著降低（0.25±0.036，P＜0.05）；6種抑癌基因的mRNA水平均顯著增加（MT1G 1.403±0.190、NMES1 1.720±0.060、RRAD 1.390±0.160、SFRP1 1.493±0.120、SPARC 2.157±0.144、TFPI2 2.060±0.122，P＜0.05）。細胞增殖結果顯示，與陰性對照組及空白組比較，實驗組細胞增殖能力顯著降低（0.554±0.130，P＜0.05），陰性對照組和空白組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。細胞凋亡結果提示，實驗組細胞凋亡細胞頻率為9.222%較陰性對照組（0.246%）及空白組（0.123%）明顯增加（P＜0.05），空白組與陰性對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。結論HPV16導致細胞惡性轉化過程中，E7可能通過抑制（MT1G、NMES1、RRAD、SFRP1、SPAR、TFPI2）6種抑癌基因的表達參與作用。

人乳頭瘤病毒16；乳頭瘤病毒E7蛋白質類；細胞增殖；細胞凋亡；SiRNA；抑癌基因

人乳頭瘤病毒（HPV）在多種腫瘤發生發展過程中的作用已得到廣泛認同。高危型HPV感染是受染細胞發生惡性轉化的必要條件，其中＞50%的HPV相關腫瘤與HPV16相關，因此針對HPV16的研究最為廣泛，E6/E7基因是發揮致癌作用的主要分子，E6/p53?E7/pRB路徑是致病的重要機制之一。越來越多的研究提示，除了上述途徑之外，HPV16還可能通過其他途徑直接或間接導致細胞惡性轉化［1?3］。Sova等［4］通過生物芯片技術，分析HPV16陽性腫瘤細胞株，結果顯示，23種基因的表達出現顯著變化，其中，金屬硫蛋白1G（metal?lothionein 1G，MT1G）、正常黏膜食管特異性蛋白1（normalmucosaofesophagus?specific 1gene，NMES1）、Ras相關GTP酶（ras?related GTPase gene，RRAD）、分泌型卷曲相關蛋白1（secreted frizzled?related protein 1 gene，SFRP1）、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）、組織因子通路抑制劑2（tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2），6種基因表達顯著降低，因而認為它們在腫瘤發展過程中發揮抑癌基因作用。高危型HPV的持續感染是細胞惡性轉化的必要條件，我們推測這6種基因表達水平的降低可能與HPV16感染相關，但該研究結果尚未見報道。我們用HPV16E7小干擾RNA（SiRNA）沉默SiHa（HPV16陽性）細胞內的HPV16E7蛋白，研究沉默前后細胞的增殖及凋亡的變化，及上述6種基因表達的變化，為進一步研究相關基因的功能，深入探討HPV 16致病機制奠定基礎。

材料和方法

一、材料

1.材料：SiHa細胞株（本實驗室保存），DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、OPTI?MEM（美國 Gibco公司）。Lipofectamin2000、Trizol?Reagent（美 國Invitrogen公司），Prime ScriptTMRT reagent Kit（日本 Takara公司），QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒（德國Qiagen公司），CCK?8試劑盒（日本同仁化學研究所），Annexin V?FITC凋亡檢測試劑盒（美國eBioscience公司）。

2.SiRNA及PCR引物：由美國Invitrogen公司設計及合成HPV16 E7靶向SiRNA（序列為CAGAGGA GGAGGAUGAAAUAGAUGG），經Blastn（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）驗證。使用Primer Premier 5.0設計HPV16E7、6種抑癌基因及β肌動蛋白的qPCR定量引物（表1），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

二、方法

1.SiHa細胞培養及分組：復蘇后于DMEM培養基（10%胎牛血清）培養細胞（37℃、5%二氧化碳），胰酶消化傳代，3次傳代后進行下一步實驗。傳代后SiHa細胞分為實驗組、陰性對照組和空白組。實驗組細胞轉染E7 SiRNA，陰性對照組轉染空載體，空白組未轉染。

2.SiHa細胞轉染及形態學觀測：按Lipofectamin2000試劑盒說明書要求進行轉染，將細胞接種至6孔板，轉染前2 h更換OPTI?MEM無血清細胞培養基。將SiRNA或空載質粒（100 pmol）和Lipofectamine 2000（6 μl），分別加至 250 μl的無血清培養基中，室溫靜置5 min混勻2種懸液，室溫靜置20 min。最后將SiRNA混合液加至6孔板中，于37℃培養箱中培養。轉染6 h后，更換為含血清培養基。用相差顯微鏡對轉染后48 h的3個組SiHa細胞進行觀察。

3.qPCR檢測mRNA水平：

（1）RNA提取：洗滌轉染細胞，每孔加1 ml Trizol試劑，細胞完全裂解后移至1.5 ml離心管，室溫放置10 min。每管加入200 μl氯仿，混勻15 s，靜置后離心。新微量離心管取上層水相，每管加入500 μl預冷異丙醇混勻，室溫靜置10 min后離心。每管加入1 ml 75%冰乙醇洗滌，室溫自然干燥，將所得RNA溶于DEPC水中，備用。

表1 HPV16 E7、6種抑癌基因及β肌動蛋白的qPCR定量引物

（2）反轉錄：按說明書在無RNA酶的PCR管中配制如下反應體系：RNA樣品1 μg，Mix 4 μl，水補充反應體系至20 μl。將反應體系輕混勻，將反應體系置入PCR儀，設置循環模式（37℃15 min，85℃5 s）。完成后所得cDNA于4℃保存備用。

（3）qPCR檢測mRNA水平變化：Qu按antiFast SYBR GreenPCR試劑盒說明書要求于冰上在96孔板中配制如下反應體系：PCR Master Mix 10 μl，引物F/R各0.5 μl，cDNA 1 μl，雙蒸水8 μl。分別加入96孔板，輕輕混勻。設置循環模式如下：50℃2 min；95℃ 5 min；95℃ 20 s，60℃ 30 s（40個循環）；95℃15 s，60 ℃ 60 s，5 ℃ 15 s。

4.增殖活性檢測：按CCK?8試劑盒說明操作，分組方法參照上述實驗分組，各組均設3個復孔。于96孔板中每孔加入5×103個細胞，定容至100 μl，培養過夜。次日進行轉染（方法同前）。轉染后48 h每孔加入10 μl CCK?8試劑，繼續培養1 h。后用紫外分光光度儀檢測每孔450 nm波長的吸光度A值。

5.細胞凋亡檢測：按Annexin V?FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作。取轉染后48 h細胞，將原細胞培養液吸出至干凈離心管內。洗滌貼壁細胞后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化細胞1～2 min。加入之前收集的原細胞培養液，吹打使之形成單細胞懸液。移至15 ml離心管，離心后棄上清，用PBS重懸細胞并計數。取5×104個重懸的細胞，離心后棄上清，加入195 μl Annexin V?FITC結合液后加入5 μl Annexin V?FITC混勻。室溫避光孵育10 min，離心后棄上清。加入190 μl Annexin V?FITC結合液及10 μl碘化丙錠染色液，混勻后避光放置。隨即用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

6.統計學方法：實驗結果取3次重復均值。用SPSS16.0軟件進行統計學分析。數據以±s表示，用單因素方差分析分析組間的顯著性。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、轉染后細胞形態

倒置光學顯微鏡下可見轉染前細胞生長狀態良好，多數細胞貼壁生長，細胞形態呈梭形或星形（圖1A）；轉染48 h后，3個組間細胞貼壁情況無明顯差別，但實驗組（圖1B）及陰性對照組（圖1C）細胞胞質內出現大量空泡，空白組（圖1D）未見明顯空泡。另實驗組細胞匯合度較陰性對照組及空白組（圖1D）低，大量細胞形態由梭形或星形變為圓形。

二、qPCR檢測mRNA表達變化

為進一步明確SiRNA干擾效果、對E7表達的影響，以及E7沉默后對6種抑癌基因的影響，我們用qPCR對3個組細胞中相關基因的mRNA表達水平進行分析。實驗結果顯示（圖2），與陰性對照組（0.963±0.040）及空白組（0.990±0.017）相比，實驗組E7 mRNA顯著降低（0.25±0.036，P＜0.05）；6種抑癌基因的mRNA水平均顯著增加（MT1G 1.403±0.190、NMES1 1.720 ± 0.060、RRAD 1.390 ± 0.160、SFRP1 1.493 ± 0.120、SPARC 2.157 ± 0.144、TFPI2 2.060±0.122，P＜0.05），陰性對照組和空白組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

三、檢測轉染后細胞增殖情況

轉染后48 h，收集3個組SiHa細胞，利用CCK?8試劑分析細胞增殖情況（圖3）。與陰性對照組及空白組相比較，實驗組細胞增殖顯著降低（0.554±0.130）（P＜0.05）。陰性對照組（1.028±0.236）和空白組（1.220±0.126）之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 轉染前后SiHa細胞生長狀態（倒置光學顯微鏡×400） 1A：轉染前，細胞形態呈梭形或星形；1B：實驗組（轉染siRNA 48 h后），胞質內出現大量空泡；1C：陰性對照組（轉染空載體后48 h），胞質內出現大量空泡；1D：空白組（未轉染、連續培養48 h后）未見明顯空泡

四、細胞凋亡

流式細胞儀檢測細胞凋亡頻率（圖4）。結果提示，3個組細胞凋亡的頻率均較低，但實驗組細胞凋亡頻率為9.222%較實驗組及空白組顯著增加（P＜0.05），空白組與陰性對照組凋亡頻率分別為0.246%及0.123%，差異無統計學意義（P＞0.05）。

討 論

圖2 轉染后48 h，qPCR分析mRNA表達水平

圖3 轉染后48 h細胞增殖情況

RNA干擾在細胞體內對于基因的調控以及防御外界病毒的入侵起到了重要作用，主要是通過促進相關mRNA降解而達到使基因沉默的結果［5］。E6/p53?E7/pRB路徑是HPV16導致細胞惡性轉化的重要路徑之一，其中E7與pRB蛋白結合使轉錄因子E2F被釋放，后者激活基因轉錄，促進了眾多細胞增殖相關基因的轉錄，從而導致細胞凋亡受抑制及細胞惡性轉化［6?7］。但近年的研究表明，HPV16E7除了通過E7/pRB途徑導致細胞惡性轉化及腫瘤的發生外，還可通過其他途徑直接或間接導致腫瘤的形成。如E7可以和其他RB相關的pocket蛋白結合，如p107及p130等，導致這些蛋白通過泛素途徑降解［8］。此外E7蛋白基因的表達還可導致多種細胞周期負向調控信號失效，如TGF?β介導的生長抑制、p16介導的細胞周期停滯、p21和p27介導的G1/S轉換阻滯等［9］。

Sova等［4］利用HPV16陽性腫瘤細胞株及相關臨床標本，采用生物芯片測序等技術，得出MT1G，NMES1，RRAD，SFRP1，SPARC和TFPI2基因與腫瘤的發生和形成密切相關，這6種基因均為高甲基化，mRNA表達降低，發揮抑癌基因功能。我們推測HPV16 E7可能與上述抑癌基因高甲基化導致的表達降低有關，因此我們用E7靶向SiRNA沉默SiHa細胞株中的E7，研究沉默前后上述6種抑癌基因的表達、細胞生長狀況及細胞凋亡情況的變化，以期進一步研究E7的功能。

本實驗結果表明，E7 SiRNA可以成功導致HPV16 E7mRNA表達降低75%左右。與此同時，發現6種抑癌基因的mRNA水平均明顯升高，與陰性對照組及空白組有顯著差異。該結果提示，HPV16 E7與抑癌基因的低表達相關，但其作用機制尚需進一步研究。我們推測E7可能與甲基化酶發生直接或間接的作用，使得這些基因的甲基化水平升高，進而導致其mRNA表達降低。HPV16陽性腫瘤細胞系需要通過不斷增殖且保持抗凋亡性以維持細胞惡性狀態［10］。在一些病毒相關腫瘤，抗細胞凋亡的活動通常來自病毒蛋白［11］。因此，我們通過CCK?8檢測增殖活性改變，并且通過流式細胞儀檢測轉染后細胞凋亡改變。實驗結果表明，實驗組腫瘤細胞的增殖活性較陰性對照組及空白組明顯下降，凋亡水平較陰性對照組及空白組明顯升高。進一步說明E7可以促進細胞增殖維及抑制細胞凋亡，從而維持腫瘤細胞惡性狀態。

圖4 轉染后48 h流式細胞儀分析細胞凋亡頻率 4A：實驗組；4B：陰性對照組；4C：空白組

本研究的結果表明，HPV16E7不僅可以導致靶細胞的增殖和凋亡發生改變，而且可導致抑癌基因的mRNA表達均降低。HPV 16是否通過與DNA甲基化酶的直接和或間接的作用，使目的基因的甲基化水平升高，mRNA表達降低，進而發揮HPV 16的致病功能，尚待進一步研究。

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（本文編輯：吳曉初）

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Effects of a small interfering RNA targeting HPV16E7 on proliferation and apoptosis of SiHa cells and expressions of six tumor suppressor genes

Long Jia,Li Liming,Xu Cui,Yang Jia,Jiang Mingjun
Department of Dermatology,Shenzhen Second People's Hospital,The First Affiliated Hospital of Shenzhen University，Shenzhen 518035,China（Long J）;Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China（Li LM,Xu C,Yang J,Jiang MJ)

ObjectiveTo evaluate effects of human papilloma virus（HPV）16E7 on expressions of six tumor suppressor genes（including MT1G,NMES1,RRAD,SFRP1,SPARC and TFPI2）in a cell line SiHa,as well as on its proliferation and apoptosis.MethodsSiHa cells were divided into two groups to be transfected with a small interfering RNA targeting HPV16E7（E7SiRNA,experimental group）and an empty vehicle（negative control group）respectively,with SiHa cells receiving no treatment serving as the blank control group.After 48 hours,qPCR was performed to measure the mRNA expressions of E7 and six tumor suppressor genes,CCK?8 assay to evaluate cellular proliferative activity,and flow cytometry to assess apoptosis of SiHa cells.ResultsAt 48 hours after the transfection,the experimental group showed significantly decreased E7 mRNA expression（0.25±0.036,P＜ 0.05）,but increased mRNA expressions of the six genes（MT1G 1.403±0.190,NMES1 1.720±0.060,RRAD 1.390±0.160,SFRP1 1.493±0.120,SPARC 2.157±0.144,TFPI2 2.060±0.122,allP＜0.05）.The proliferative activity of SiHa cells was significantly decreased（0.554±0.130vs.1.028±0.236 and 1.220±0.126,bothP＜0.05）,but the apoptosis rate was significantly increased（9.222%vs.0.246%and 0.123%,bothP＜ 0.05）in the experimental group compared with the negative control group and blank control group.No significant differences were observed between the negative control group and blank control group in proliferative activity or apoptosis rate of SiHa cells（bothP＞ 0.05）.ConclusionE7 may participate in HPV16?induced cellular malignant transformation by suppressing the mRNA expressions of 6 tumor suppressor genes,including MT1G,NMES1,RRAD,SFRP1,SPAR and TFPI2.

Human papillomavirus 16;Papillomavirus E7 proteins;Cell proliferation;Apoptosis;SiRNA;Tumor suppressor genes

Jiang Mingjun,Email:drmingjunjiang@163.com

2016?03?02）

蔣明軍，Email：drmingjunjiang@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.10.009

國家自然科學基金（31470274）；江蘇省臨床醫學研究中心項目（BL2012003）；中央級公益性科研院所基本科研業務費（2016RC310025）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（31470274）;Clinical Research Center Program of Jiangsu Province（BL2012003）;Special Fund for Basic Scientific Research Business of Central Public Research Institutes（2016RC310025）