X連鎖顯性遺傳性原卟啉癥一家系及ALAS2基因突變分析

王濤 董琦 徐晨琛 周細平 劉躍華 王宏偉 孫秋寧 晉紅中 鄭和義歐陽云淑 栗春佳 陳蓉蓉 張宏冰 劉雅萍 王永偉 聶廣軍

100730北京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院皮膚科（王濤、董琦、徐晨琛、周細平、劉躍華、王宏偉、孫秋寧、晉紅中、鄭和義），超聲醫學科（歐陽云淑）；中國醫學科學院 北京協和醫學院 基礎研究所生理和病理生理系、醫學分子生物學國家重點實驗室（栗春佳、陳蓉蓉、張宏冰），遺傳學系（劉雅萍）；國家納米科學中心（王永偉、聶廣軍）

X連鎖顯性遺傳性原卟啉癥一家系及ALAS2基因突變分析

王濤 董琦 徐晨琛 周細平 劉躍華 王宏偉 孫秋寧 晉紅中 鄭和義歐陽云淑 栗春佳 陳蓉蓉 張宏冰 劉雅萍 王永偉 聶廣軍

100730北京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院皮膚科（王濤、董琦、徐晨琛、周細平、劉躍華、王宏偉、孫秋寧、晉紅中、鄭和義），超聲醫學科（歐陽云淑）；中國醫學科學院 北京協和醫學院 基礎研究所生理和病理生理系、醫學分子生物學國家重點實驗室（栗春佳、陳蓉蓉、張宏冰），遺傳學系（劉雅萍）；國家納米科學中心（王永偉、聶廣軍）

目的報道中國人X連鎖顯性遺傳性原卟啉癥一家系，并對其5?氨基酮戊酸合成酶2（ALAS2）基因突變進行研究。方法收集該家系成員資料，進行臨床調查。用二代測序方法檢測后再行Sanger測序，測定該家系中患病者及部分表型正常者ALAS2致病基因。用皮膚鏡觀察皮膚卟啉皮損，根據Fotofinder系統和甚高頻皮膚超聲系統評估皮膚卟啉癥的光損傷嚴重程度，對該家系成員做肝膽B超檢查，同時檢測血液學改變。結果該家系中所有患者X染色體的1706號到1709號堿基發生AGTG缺失，導致轉錄時移碼突變，最終導致翻譯得到的ALAS2酶C端19、20個殘基替換或缺失，ALAS2酶活性升高。XLDPP患者皮膚光損傷顯著，肝膽可出現卟啉損傷，隨年齡增加而加重，可出現貧血和鐵過載。結論X染色體1706?1709堿基AGTG缺失突變可能是該ALDPP家系患者的發病原因。

卟啉病，紅細胞生成性；遺傳性疾病，X連鎖；DNA突變分析；5?氨基酮戊酸合成酶2基因；光老化

X連鎖顯性遺傳性原卟啉癥［X?linked dominant protoporphyria（XLDPP），MIM no.300752］是一種自幼發病的原卟啉癥，由5?氨基酮戊酸合成酶2（5?aminolevulinic acid synthetase 2，ALAS2）C決定區突變引起的功能改變所致，該酶是血紅蛋白合成途徑中第1個酶的紅細胞特異性亞型［1］。臨床上出現兒童甚至新生兒期發病且持續終身的光敏感，部分患者出現肝病。我們針對一個XLDPP家系進行二代測序（next generation sequencing，NGS）發現ALAS2（1606?1609，ΔAGTG）缺失突變，并通過Sanger測序驗證確診；同時還對XLDPP的臨床特征等進行描述。經中國醫學科學院醫學信息研究所查新報告顯示:國內外檢索未見報道中國人X連鎖顯性遺傳性原卟啉癥一家系，并對其ALAS2基因突變進行研究的文獻報道。本文為首例報道。

資料與方法

一、病歷資料

先證者男，7歲。因面部多發瘢痕、日曬后癢痛7年來診。父母訴患兒自出生后，外出曬太陽數小時后出現面部雙手等曝光部位紅腫、癢痛，搔抓后出現瘢痕和結痂。避光后癢痛可緩解，但瘢痕不能消退。無紅尿、畏光；牙齒不潔凈，尚整齊。皮膚科檢查：面部、耳廓、雙手背見顯著增厚的紅斑、斑片，伴有萎縮和增厚的痘瘡樣瘢痕，面部見抓痕和血痂，鼻背部點狀蟲蝕狀凹陷性瘢痕，口周放射紋。見圖1。

圖1 先證者面部、耳廓見顯著增厚的紅斑、斑片，伴有萎縮和增厚的痘瘡樣瘢痕，面部見抓痕和血痂，口周放射紋

對該先證者所在家系進行調查，繪制家系圖（圖2）。先證者母親、姨媽、外祖母、曾外祖母、表姨和該表姨1個兒子均有類似癥狀。先證者母親皮膚膚色基本正常，訴有日曬后面部和雙手的癢痛，未起過水皰。姨媽出現過光暴露后面部輕度刺痛，無瘢痕和水皰的病史；外祖母、外姨祖母、表姨皮損均表現為褐黃色膚色，面部和手背皮膚增厚，紋理明顯增粗。先證者一表哥16歲，訴幼時與先證者癥狀和體征類似，目前曝光部位膚色深，面部彌漫性增厚和萎縮性瘢痕，但無日曬后癢痛感。

二、方法

在該家系成員簽署知情同意書后，收集該家系成員（Ⅱ2，Ⅱ8，Ⅲ1，Ⅲ2，Ⅲ3，Ⅲ4，Ⅳ1，Ⅳ2，Ⅳ3）外周血，行實驗室檢查，包括血常規、生化、網織紅細胞、轉鐵蛋白等。對該家系以上成員行肝膽B超檢查、皮膚鏡檢查和甚高頻（very high frequency，VHF）皮膚B超檢查，并用Fotofinder系統行皮膚老化評估［2］。對先證者皮損活檢，行HE染色和過碘酸希夫（PAS）染色。留取先證者（Ⅳ1）、先證者父母（Ⅲ1，Ⅲ2）、弟弟（Ⅳ2）和姨媽（Ⅲ3）的外周血，提取基因組DNA，行NGS和Sanger測序，用家族中未患病者（Ⅲ1和Ⅳ2）和100例健康人做對照。

結 果

一、血液學檢查

先證者、患病表哥紅細胞內游離原卟啉升高。患病者（Ⅱ2，Ⅱ8，Ⅲ2，Ⅲ3，Ⅲ13，Ⅳ1，Ⅳ3）存在不同程度的鐵缺乏（包括血清鐵、鐵飽和度、轉鐵蛋白飽和度、鐵蛋白均下降）。

二、肝膽B超檢查

該XLDPP家系中，先證者的外祖母（Ⅱ2）和表姨（Ⅲ13）均已行膽囊切除術。表哥（Ⅳ3）膽囊增大，膽囊多發息肉，最大直徑0.23 cm。

三、皮膚鏡檢查結果

圖2 X連鎖顯性遺傳性原卟啉癥家系圖

均選擇鼻背部瘢痕處行皮膚鏡檢查：先證者母親（Ⅲ2）：淡紅斑片，網狀白斑。先證者（Ⅳ1）：棕黃色背景，可見大量毛囊角栓，毛囊周圍可見白暈，散在褐色點狀色素沉著，可見明顯的線狀及網狀白斑，部分區域可見破潰、結痂。先證者患病表哥（Ⅳ3）：棕黃色背景、大量的一致性分布的褐色點狀色素沉著、囊泡狀色素沉著，明顯的線狀及網狀白斑，散在棕色斑片。

四、VHF皮膚B超檢查結果

先證者面部皮膚表皮層增厚明顯，真皮層內彌漫性低回聲，占位感不明顯，形態不規則。

五、Fotofinder光老化評估

根據Fotofinder系統對先證者面部評分，結果顯示：毛孔粗大程度＞14%的同齡人；紫外線損傷程度＞85%同齡人；面部發紅程度＞58%同齡人；皺紋嚴重程度＞83%同齡人；皮膚光滑度＜84%同齡人。

六、皮膚組織病理表現

取先證者右側顳上部暴露日光處瘢痕組織行病理檢查，結果顯示：表皮內見空泡化細胞，局灶性角化不全；真表皮交界處見多發的裂隙；真皮全層增厚，可見增生粗大的膠原纖維束，嗜堿性明顯，真皮乳頭層結構紊亂，見毛細血管擴張充血，血管增生明顯。皮下脂肪未見異常，見圖3。

七、測序結果

經NGS測序后Sanger測序驗證，該家系中患病者X染色體的1706號～1709號堿基有AGTG的缺失突變（ALAS2 c.1706 ?1709delAGTG；g.26827_26830）。見圖4。家系中未患病者以及正常對照者未見類似突變。

討 論

圖3 先證者右顳部曝光部位皮膚病理改變（HE×200） 表皮內見空泡化細胞，局灶性角化不全；真表皮交界處見多發的裂隙；真皮全層增厚，可見增生粗大的膠原纖維束，嗜堿性明顯，真皮乳頭層結構紊亂，見毛細血管擴張充血，血管增生明顯

2008年XLDPP首次由Whatley等報道，目前世界上報道的病例不超過50例［1］，較為罕見。XLDPP主要是男性受累，患者常在曝光后數分鐘內自覺皮膚出現針刺、燒灼、疼痛和瘙癢的感覺，并且出現紅腫等光敏感為主要表現。兒童甚至嬰兒期即可發病。較少出現水皰，但可因患者的搔抓出現結痂、糜爛等。很多患者皮膚曝光后，疼痛可超出曝光部位，且持續數小時甚至數日。光敏性常持續終身，最終患者因反復出現的急性發作出現慢性光損傷性改變，如苔蘚化、皮膚如皮革狀質地的假水皰、口周放射紋等，指甲扁平。雜合子女性患者可完全無癥狀，也可同男性一樣受累嚴重。

目前發現導致XLDPP的ALAS2基因突變包括 c.1706?1709 delAGTG（p.E569GfsX24）、c.1699?1700delAT（p.M567EfsX2）、c.1642C ＞ T（Q548X）和c.1651?1677del（S551PfsX5），位于 11 號外顯子［1，3］。本研究發現的突變是已知的c.1706?1709 delAGTG（p.E569GfsX24），為框移突變，影響ALAS酶的19?20C決定區殘基，導致酶活性顯著增加。本研究中，男性患者病變均較重，而女性患者皮損表現輕微，甚至無皮損，但年齡增大后，女性出現膽囊結石，甚至需要切除膽囊。男性患者較女性為重，這一現象可能與X染色體失活（lyonization）有關［4］。但膽囊病變與既往報道差異較大［5］，需進一步觀察。

XLDPP診斷主要依靠明確的基因檢測結果［1］。臨床上主要與紅細胞生成性原卟啉病（EPP）鑒別。表型嚴重的XLDPP患者體內原卟啉IX含量較紅細胞生成性原卟啉病（EPP）更高，因此患者的痛性光敏反應以及肝損可能比EPP更重［6］。鑒別XLDPP與EPP非常重要，一個簡單易行的方法是根據家系圖受累患者進行分析，若患者家族人口多，那么明確診斷的可能性大。一般可以通過患病者性別的差異來初步判定，最終還需要致病基因的檢測確診。

圖4 Sanger測序結果顯示患者4個堿基缺失 上方為參考序列，下方為突變序列，紅框示4個缺失的堿基（ALAS2 c.1706?1709，delAGTG）

我們使用皮膚鏡評估光損傷的嚴重程度，從結果來看，XLDPP患者曝光處皮膚光損傷嚴重，一方面，可見到大量的毛囊角栓，另外可見到結痂，這些均在正常孩子面部很難見到。VHF也是最近幾年來用于皮膚科診斷的一種新型手段，優點是無創，直觀。我們用VHF進行XLDPP光損傷嚴重程度評分觀察，因缺乏足夠多的病例數以及對比研究，尚不能完全利用VHF來評估XLDPP以及其他卟啉癥的嚴重程度。但對于面部這些皮膚活檢等有創操作有禁忌的部位，將來可以嘗試以皮膚鏡和VHF作為輔助手段，評估XLDPP的損傷嚴重程度。

目前XLDPP治療尚無良策。可以囑咐患者進行避光，對患者家系進行遺傳咨詢，尤其是說明男性患病者較女性嚴重，對患者家屬會有一定幫助。

［1］Whatley SD,Ducamp S,Gouya L,et al.C?terminal deletions in the ALAS2 gene lead to gain of function and cause X?linked dominant protoporphyria without anemia or iron overload［J］.Am J Hum Genet,2008,83（3）:408?414.DOI:10.1016/j.ajhg.2008.08.003.

［2］Levy JL,Trelles MA,Levy A,Besson R.Photography in dermatology:comparison between slides and digital imaging［J］.J Cosmet Dermatol,2003,2（3?4）:131?134.DOI:10.1111/j.1473?2130.2004.00081.x.

［3］Ducamp S,Schneider?Yin X,de Rooij F,et al.Molecular and functional analysis of the C?terminal region of human erythroid?specific 5?aminolevulinic synthase associated with X ?linked dominant protoporphyria（XLDPP）［J］.Hum Mol Genet,2013,22（7）:1280?1288.DOI:10.1093/hmg/dds531.

［4］Brancaleoni V,Balwani M,Granata F,et al.X?chromosomal inactivation directly influences the phenotypic manifestation of X?linked protoporphyria［J］.Clin Genet,2016,89（1）:20?26.DOI:10.1111/cge.12562.

［5］Ninomiya Y,Kokunai Y,Tanizaki H,et al.X?linked dominant protoporphyria:the first reported Japanese case［J］.J Dermatol,2016,43（4）:414?418.DOI:10.1111/1346?8138.13101.

［6］Seager MJ,Whatley SD,Anstey AV,et al.X?linked dominant protoporphyria:a new porphyria［J］.Clin Exp Dermatol,2014,39（1）:35?37.DOI:10.1111/ced.12202.

（本文編輯：尚淑賢）

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本刊“臨床病例討論”欄目征稿啟事

本刊已開設“臨床病例討論”欄目，目的是給臨床醫生提供一個學習討論與提高臨床技能的園地，2015年第3期已刊出一篇。現向全國各大醫院征集“臨床病例討論”稿。要求：所選病例應是皮膚性病學科的疑難病和少見病例，有較清晰的診治過程、有明確的經驗教訓；或診斷明確，但治療棘手，最終治療成功或顯效者。病例臨床資料完整，能提供必要的實驗室、影像學和組織病理等確診證據（需提供臨床皮損及治療前后對比的圖片，組織病理圖片等）。寫作格式：前言、病歷資料、討論（可以用病例討論時依次發言的形式，也可以按臨床醫師診療思路，經過歸納，條理清楚地總結）、參考文獻。文稿字數以3 000字左右為宜。歡迎踴躍投稿。

X?linked dominant protoporphyria:report of a pedigree and detection of ALAS2 gene mutations

Wang Tao,Dong Qi,Xu Chenchen,Zhou Xiping,Liu Yuehua,Wang Hongwei,Sun Qiuning,Jin Hongzhong,Zheng Heyi,Ouyang Yunshu,Li Chunjia,Chen Rongrong,Zhang Hongbing,Liu Yaping,Wang Yongwei,Nie Guangjun
Department of Dermatology,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730,China（Wang T,Dong Q,Xu CC,Zhou XP,Liu YH,Wang HW,Sun QN,Jin HZ,Zheng HY）;Department of Ultrasound Medicine,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730,China（Ouyang YS）;State Key Laboratory of Medical Molecular Biology,Department of Physiology and Pathophysiology,Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730,China（Li CJ,Chen RR,Zhang HB）;Department of Medical Genetics,Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730,China（Liu YP）;National Center for Nanoscience and Technology of China,Beijing 100190,China（Wang YW,Nie GJ）

ObjectiveTo report a pedigree with X?linked dominant protoporphyria（XLDPP）,and to detect 5?aminolevulinic acid synthetase 2（ALAS2）gene mutations in this pedigree.MethodsA clinical investigation was performed in a pedigree with XLDPP,and relevant data were collected from family members.A next?generation sequencing method was applied to screen possible mutation sites,and Sanger sequencing was performed to determine pathogenic gene mutations.Dermoscopy was conducted to observe skin lesions in the patients with XLDPP,and the Fotofinder system and very high frequency（VHF） ultrasound system were utilized to assess the severity of photodamage.Liver and gallbladder ultrasonography as well as blood examination were performed for all the family members.ResultsA deletion mutation,c.1706?1709 ΔAGTG,was detected in the ALAS2 gene on the X chromosomes of all the patients in this family,which led to replacement or loss of 19-20 C?terminal residues through transcriptional frameshifting,and eventually caused an increase in ALAS2 activity.In the patients with XLDPP,skin photodamage was relatively severe;protoporphyrin?induced hepatobiliary damage was observed and aggravated with age;anemia and iron deficiency occurred sometimes.ConclusionThe deletion mutation c.1706?1709 ΔAGTG of the ALAS2 gene may be the underlying cause of XLDPP in this pedigree.

Porphyria,erythropoietic;Genetic diseases,X?linked;DNA mutational analysis;5?Aminolevulinic acid synthetase 2 gene;Photoaging

Liu Yuehua,Email:yuehualiu@263.net

2016?04?25）

劉躍華，Email:yuehualiu@263.net

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.10.005